Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo's met Heat Shock 2 Treatment

Summary

Een gewijzigde protocol voor ploïdie manipulatie maakt gebruik van een heat shock naar een één-cyclus kraam in cytokinese induceren in de vroege embryo. Dit protocol wordt gedemonstreerd in de zebravis, maar kan voor andere soorten.

Abstract

Manipulatie van ploïdie zorgt voor nuttige transformaties, zoals diploïde te tetraploïden of haploïden te diploïde. In de zebravis Danio rerio bijzonder de productie van homozygote gynogenetic diploïde nuttig in genetische analyse omdat het de directe productie van homozygoten van een heterozygote moeder. Dit artikel beschrijft een gemodificeerd protocol voor ploïdie duplicatie op basis van warmte puls tijdens de eerste celcyclus, Heat Shock 2 (HS2). Door remming van centriole duplicatie deze werkwijze resulteert in een precieze celdeling stall tijdens de tweede celcyclus. De precieze één cyclus divisie stal, gekoppeld aan onaangetast DNA duplicatie, resulteert in een hele genoom duplicatie. Protocollen in verband met deze methode zijn ei en sperma inzameling, UV-behandeling van sperma, in vitro fertilisatie en warmte puls naar een one-celcyclus divisie vertraging en ploïdie duplicatie veroorzaken. Een aangepaste versie van dit protocol kunnen worden toegepastom ploïdie veranderingen in andere diersoorten induceren.

Introduction

Dit protocol maakt de manipulatie van ploïdie in zebravisembryo's, bijvoorbeeld bij het genereren van homozygote diploïde gynogenetic van gynogenetic haploïden (figuur 1) of de productie van tetraploïden. Dit wordt bereikt door het induceren van een vertraging in cytokinese overeenkomt met precies een celcyclus (Figuur 2A, 2B). De sleutel van één cyclus vertraging cytokinese wordt bereikt door behandeling met hitteschok. Het standaardprotocol van hitteschok (HS) zoals oorspronkelijk beschreven door Streisinger en collega betrokken temperatuur puls gedurende de periode 13-15 MPF, resulterend in één cyclus celdeling stall tijdens de eerste celcyclus ^1. De efficiëntie van dit protocol is onlangs verbeterd door het scannen van de eerste celdelingen met een glijdende vensterfuncties van hitteshockbehandeling. Deze scan identificeerde een later tijdstip voor een warmteschok, nog binnen de eerste celcyclus (22-24 MPF), wat resulteert in een hoger embryos met één cyclus celdeling box, die in dit geval beïnvloedt de tweede celcyclus ^2. De waarneming dat experimentele manipulaties in de eerste celcyclus verstoren celdeling tijdens de tweede celcyclus en leiden tot DNA-inhoud duplicatie is eveneens beschreven in andere vissoorten ^3,4. We noemen dit gemodificeerde protocol Heat Shock 2 (HS2 – de term "2" geeft de warmte puls plaats op een later tijdstip dan de standaard HS methode, en dat de celcyclus vertraging veroorzaakt door HS2 optreedt in de tweede celcyclus ). Deze studies toonden aan dat de basis voor cytokinese arrestatie na hitteschok de remming van centriole overlapping tijdens de hitte puls, welke spil vorming en groef inductie in de volgende celcyclus beïnvloedt. HS2 resultaten in opbrengsten van de celcyclus bijna 100%, en de tarieven van ploïdie duplicatie tot 4 keer hoger dan standaard HS ^2.

Embryo's behandeld witha heat shock tijdens blastomere celdeling vertonen veel schadelijke effecten, wat erop wijst dat heat shock invloed op meerdere processen die nodig zijn voor de celdeling ^2. Anderzijds, indien de heat shock voorafgaand aan de initiatie van celdeling (tijdsperiode 0-30 MPF) wordt toegepast, blijkt het effect consistent met specifieke interferentie met centriole overlapping hebben en lijkt geen andere essentiële cellulaire processen beïnvloeden ² . Deze studies toonden aan dat de tijd voorafgaand aan de inleiding van blastomere divisie lijkt een ontwikkelingsperiode vatbaar is voor het gebruik van Heat Shock als een instrument om specifiek te manipuleren door middel van ploïdie centriole remming zijn. De onderliggende oorzaak van de schijnbare selectiviteit voor warmteschok op centriole duplicatie is niet bekend, maar kan verband houden met een selectieve afbraak van centrosoom substructuren waargenomen onder hittestress in bepaalde celtypen, zoals leukocyten ^5.

Tijdelijke synchronisatie van de embryonalekeling wordt bereikt door in vitro fertilisatie (IVF). Het gebruik van onbehandelde sperma tijdens de bevruchting resulteert in diploïde embryo's dat bij HS2-geïnduceerde één cyclus cytokinese kraam tetraploïde geworden. Het gebruik van UV-behandelde sperma, die verknopingen dat zijn DNA inactiveren, leidt gynogenetic haploïde embryo ^6, dat bij HSII geïnduceerde één cyclus cytokinese stall worden gynogenetic diploïde ² draagt. Door het resulterende gehele genoom duplicatie deze gynogenetic diploïden homozygoot bij elke locus in het genoom. Beknoptheid wordt verwezen naar haploïde embryo gynogenetic als "haploïden" en homozygote gynogenetic diploïde embryo's "homozygote diploïde". Als levensvatbaar en vruchtbaar, kunnen homozygote diploïde worden gebruikt om steriele en dodelijke-vrije lijnen te starten. Direct homozygosity geïnduceerd door HS2 moet ook gemakkelijk worden opgenomen in genetische analyse of genetische screens, omdat homozygote diploïde zijn van koeien die heterozygote dragers van mut zijnaties vertonen tarieven van homozygotie bij hoge en vaste (50%) verhoudingen ^2.

Het volgende protocol beschrijft de stappen om HS2 presteren en induceren ploïdie overlapping met de volledige homozygosity. Voor tetraploïde productie moet sperma oplossing onbehandeld zijn. Voor homozygote diploïde productie moet sperma worden geïnactiveerd door UV-behandeling. Bovendien, zoals beschreven in de discussie, zichtbaar pigment markers kunnen ook worden gebruikt om identificatie van homozygote diploïde vergemakkelijken. Zebravis mate in de eerste plaats tijdens de eerste 3 uur na de opening van hun licht cyclus ^7, en zowel volwassenen en eieren zijn gevoelig voor circadiaanse ritmes ^8, dus voor het beste resultaat van de IVF-procedure moet plaatsvinden binnen deze periode.

Protocol

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Wisconsin – Madison en Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen (University of Wisconsin – Madison Assurance nummer A3368-01). 1. Keuze Vrouwtjes Egg Collection via Onderbroken Mating LET OP:-IVF gebaseerde protocollen rekenen op de extrusie van rijpe eicellen van koeien door middel van handmatige druk 9. Eerdere protocollen vrouwtjes rechtstreeks gebruik van tanks of in combinatie paringen zonder vr…

Representative Results

Ondanks de één celcyclus cytokinese stal, DNA replicatie plaatsvindt normaliter in dergelijke embryo, wat resulteert in de verdubbeling van de DNA inhoud van de embryo (figuur 1). De Streisinger Heat Shock-protocol (standaard HS) betreft een warmte puls in de periode 13-15 minuten na de bevruchting (MPF) en induceert voornamelijk cytokinese arrestatie tijdens de eerste embryonale celdeling op 35 mpf 1,2, terwijl de afgeleide hier beschreven methode, aangedui…

Discussion

kritische stappen

Het is essentieel om te werken voor daadwerkelijke in vitro fertilisatie. Om een ​​goed aanbod van rijpe eicellen (stap 1) te verzekeren, het opzetten van de vrouwtjes te paren mag niet zijn opgezet in paring kruizen gedurende minstens 5 dagen en moeten zwangere verschijnen. Tijdens de onderbreking van de fokkerij, kan een waarnemer adequaat toezicht 15-30 tanks voor de eerste verschijning van de natuurlijke ei extrusie. Onderbreking van de paring moet zo snel optreden mog…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)