La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Summary

Un protocolo modificado para la manipulación de ploidía utiliza un choque de calor para inducir una parada de un ciclo en la citocinesis en el embrión temprano. Este protocolo se demuestra en el pez cebra, pero puede ser aplicable a otras especies.

Abstract

La manipulación de la ploidía permite transformaciones útiles, tales como diploides a tetraploides, o haploides a diploides. En el pez cebra Danio rerio, específicamente la generación de diploides ginogenéticos homocigotos es útil en el análisis genético, ya que permite la producción directa de los homocigotos de una sola madre heterocigotos. Este artículo describe un protocolo modificado para la duplicación de la ploidía en base a un pulso de calor durante el primer ciclo celular, Heat Shock 2 (HS2). A través de la inhibición de la duplicación de centríolos, este método resulta en un puesto de la división celular precisa durante el segundo ciclo celular. La cabina de la división de un ciclo precisa, unida a la duplicación de ADN no afectado, se traduce en la duplicación del genoma entero. Protocolos asociados a este método incluyen huevo y la recogida de esperma, el tratamiento UV de esperma, fertilización in vitro y el pulso de calor para provocar un retraso división ciclo de una célula y la duplicación de ploidía. Una versión modificada de este protocolo se podría aplicarpara inducir cambios de ploidía en otras especies animales.

Introduction

Este protocolo permite la manipulación de la ploidía en embriones de pez cebra, como en la generación de los diploides ginogenéticos homocigotos de haploides ginogenéticos (Figura 1) o la producción de tetraploides. Esto se logra mediante la inducción de un retraso en la citocinesis correspondiente a exactamente un ciclo celular (Figura 2A, 2B). El retardo de tecla de un ciclo en la citocinesis se logra mediante el tratamiento con choque térmico. El protocolo estándar de choque térmico (HS) como se describe originalmente por Streisinger y colegas involucrado un pulso de temperatura durante el período de 13 a 15 MPF, resultando en un puesto de la división celular de un ciclo durante el primer ciclo celular ^1. La eficiencia de este protocolo se ha mejorado recientemente mediante el escaneo de los ciclos tempranos de la célula con una ventana temporal de deslizamiento de tratamiento de choque térmico. Esta exploración identificado un punto de tiempo más tarde para un choque térmico, todavía dentro de la primera del ciclo celular (22-24 MPF), que resulta en una mayor tasa de EMBRyos con un puesto de la división celular de un ciclo, que en este caso afecta al segundo ciclo celular ^2. La observación de que las manipulaciones experimentales durante el primer ciclo celular interfieren con la división celular durante el segundo ciclo celular y causan ADN duplicación de contenido también se ha informado en otras especies de peces ^3,4. Nos referimos a este protocolo modificado como Heat Shock 2 (HS2 – el término "2" indica que el impulso de calor se produce en un momento más tarde que el método uniforme del SA, y que el retraso del ciclo celular causada por HS2 se produce durante el segundo ciclo celular ). Estos estudios mostraron que la base de detención citocinesis después de choque térmico es la inhibición de la duplicación centriolo durante el impulso de calor, lo que afecta a la formación del huso y la inducción surco en el siguiente ciclo celular. Resultados de HS2 en los rendimientos de la detención del ciclo celular se acercan al 100%, y las tasas de ploidía la duplicación hasta 4 veces más altos que ^la norma ² del SA.

ingenio embriones tratadosja choque térmico durante el ciclo celular blastómeras presentan muchos efectos nocivos, lo que sugiere que el choque térmico afecta a múltiples procesos necesarios para la división celular ^2. Por otra parte, si se aplica el choque térmico antes de la iniciación de ciclo celular (período de tiempo de 0-30 MPF), que parece tener efectos consistentes con la interferencia específica con la duplicación centriolo y no parece afectar a otros procesos celulares esenciales ² . Estos estudios mostraron que el tiempo antes de la iniciación de la división de blastómeros que parece ser un período de desarrollo susceptibles a la utilización de choque térmico como una herramienta para manipular específicamente ploidía través de la inhibición de centríolos. La causa subyacente de la selectividad aparente para el choque de calor en la duplicación centríolo es desconocida, pero puede estar relacionado con una degradación selectiva de subestructuras centrosoma observados bajo el estrés por calor en ciertos tipos de células, tales como leucocitos ^5.

la sincronización temporal de la de embrionariodesarrollo se logra mediante la fertilización in vitro (FIV). El uso de espermatozoides sin tratar durante resultados de fertilización in embriones diploides que al HS2 inducida por un ciclo de parada citocinesis convertido tetraploide. El uso de espermatozoides con tratamiento UV, que lleva entrecruzamientos que inactivan su ADN, da lugar a embriones haploides ginogenéticos ^6, que tras inducida por hsü un ciclo de parada citocinesis convertirse diploides ginogenéticos ^2. Debido a la duplicación del genoma completo resultante, las últimas diploides ginogenéticos son homocigotos en cada locus en todo el genoma. Por razones de concisión, nos referimos a ginogenéticos embriones haploides como "haploides", y los embriones diploides homocigóticos ginogenéticos como "diploides homocigóticos". Si viables y fértiles, diploides homocigóticos se pueden utilizar para iniciar líneas estéril y libre de letales. homocigosis directa inducida por HS2 también debería incorporarse fácilmente en el análisis genético o cribados genéticos, ya que los diploides homocigotos de hembras que son portadores heterocigotos de mutlas tasas de exposición ations de homocigosidad en (50%) y altas relaciones de fijos ^2.

El siguiente protocolo describe pasos para realizar HS2 e inducir la duplicación ploidía con plena homocigosis. Para la producción de tetraploides, solución de espermatozoides debe ser tratada. Para la producción diploide homocigotos, el esperma debe ser inactivado mediante tratamiento UV. Además, como se describe en la discusión, marcadores de pigmentos visibles pueden también ser usados ​​para facilitar la identificación de los diploides homocigóticos. Compañero de pez cebra principalmente durante las primeras 3 horas del inicio de su ciclo ^de luz ^7, y tanto los adultos como los huevos son sensibles a los ritmos circadianos ^8, por lo que para obtener mejores resultados debe producirse la fecundación in vitro dentro de este período de tiempo.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de Wisconsin – Madison y Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC) (Universidad de Wisconsin – Madison Aseguramiento número A3368-01). 1. Selección de hembras en la colección del huevo a través de apareamiento interrumpido NOTA: protocolos basados en la FIV se basan en la extrusión de huevos maduros de las mujeres a través de la presión manual 9. protocolos anteriores han ut…

Representative Results

A pesar de la parada del ciclo de la citocinesis de una célula, la replicación del ADN se produce normalmente en tales embriones, dando como resultado la duplicación del contenido de ADN del embrión (Figura 1). El protocolo Streisinger choque térmico (HS estándar) consiste en un pulso de calor durante el período de 13-15 minutos después de la fertilización (MPF) e induce principalmente detención citocinesis durante la primera división celular embrionaria a 35 …

Discussion

Los pasos críticos

Es fundamental trabajar en condiciones de eficacia en la fertilización in vitro. Para asegurar un buen suministro de óvulos maduros (paso 1), las mujeres establecieron para el apareamiento no debería haber sido creado en cruces de apareamiento durante al menos 5 días y debe aparecer grávido. Durante la interrupción de la cría, un observador puede controlar el 15-30 tanques adecuadamente para la primera aparición de la extrusión de huevo natural. La interrupción del…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)