Summary

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Published: January 01, 2017
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Summary

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos adultos e manipulações subsequentes dos músculos, como dissecção, corte, congelação, coloração de rotina e análise de células musculares área de secção transversal.

Abstract

regeneração do músculo esquelético é um processo fisiológico que ocorre em músculos esqueléticos adulto em resposta a uma lesão ou doença. a regeneração do músculo esquelético induzido por lesão aguda é um modelo amplamente usado do sistema, poderoso para estudar os acontecimentos envolvidos na regeneração muscular, bem como os mecanismos e os jogadores diferentes. Com efeito, o conhecimento detalhado deste processo é essencial para uma melhor compreensão das condições patológicas que conduzem à degeneração do músculo esquelético, e auxilia na identificação de novas estratégias terapêuticas dirigidas. O presente trabalho descreve um protocolo detalhado e reprodutível para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos por meio de uma única injecção intramuscular de cardiotoxina (CTX). CTX pertence à família de toxinas de veneno de cobra e provoca miólise de miofibras, que eventualmente provoca os eventos de regeneração. A dinâmica de regeneração do músculo esquelético é avaliada por análise histológica de secções do músculo. O protocolo tambémilustra os procedimentos experimentais para dissecar, congelação, e cortando o músculo tibial anterior, bem como a rotina de coloração com Hematoxilina e Eosina que é amplamente utilizado para a análise morfológico e morfométrico subsequente.

Introduction

músculos esqueléticos mamíferos adultos são formados por grupos de fascículos de células musculares multinucleadas (miofibras) que são especializados para contracção. Cada fibra muscular é um sincício alongado, cercado pelo sarcolema (membrana plasmática) e contendo miofibrilas, que são compostas de proteínas contráteis regularmente e repetidamente organizados (actina e miosina). Na vida adulta e em condições de repouso, músculos esqueléticos têm uma muito baixa rotatividade de seu mionúcleos 1; Com efeito, os mionúcleos, que estão localizados na periferia da fibra muscular, sob o sarcolema, são presos na fase G0 do ciclo celular e são incapazes de proliferar 1,2.

Os músculos esqueléticos têm a capacidade peculiar para regenerar seguinte danos, atingindo homeostase depois de vários eventos de remodelação de tecidos que estão fortemente relacionados uns aos outros. Após uma lesão aguda ou trauma, degeneração é induzida, seguida por processos de regeneraçãoque envolvem diferentes populações de células, incluindo uma população residente de células musculares, as células satélites (SCS). Com efeito, na ausência de quaisquer estímulos ambientais, as células satélites estão num estado de repouso e situam-se num nicho especializado entre o sarcolema e a 3,4 lâmina basal. Na sequência de uma lesão ou doença, a SCS se tornam activadas, proliferam, migram para as áreas danificadas, e, eventualmente, diferenciar-se, dando origem a recém-formadas miofibras 5. SCs ativados estabelecer cross-talk com diferentes populações de células, principalmente células inflamatórias, que são recrutadas no local do trauma 6-8. Este cross-talk permite que as células seguem um paradigma regulamentada pelo qual os sinais moleculares conduzir modificações estruturais, o que levou à homeostase 9. Além SCs, células inflamatórias e intersticiais, processos angiogénicos e eventos re-inervação também estão envolvidos, atuando de forma coordenada para reparar este altamente organizado e sestrutura pecialized.

Há um grande interesse em estudar diferentes aspectos da regeneração do músculo esquelético, não só para compreensão da fisiologia do músculo, mas também para melhorar estratégias terapêuticas que requerem conhecimento mais profundo de todo o processo. Várias abordagens experimentais estão actualmente disponíveis para estudar a identidade e função das diferentes populações de células, as vias de sinalização, e os mecanismos moleculares envolvidos. modelos de rato de lesão aguda representa uma ferramenta poderosa para investigar muitos aspectos deste processo. Diferentes técnicas vulgarmente usadas para induzir lesão muscular aguda permitem acompanhar o processo de regeneração in vivo, a partir das fases muito precoces para o final do processo. Este protocolo descreve os passos da injecção intramuscular de cardiotoxina derivado de veneno de cobra-(CTX), que induz miólise e desencadeia o processo de regeneração, até a análise de amostras de tecido. Após a injecção CTX, MIce pode ser sacrificados em diferentes pontos de tempo, dependendo dos requisitos experimentais, e os músculos esqueléticos podem ser dissecados e processados ​​para análise posterior. Finalmente, descreve-se o protocolo de coloração de secções de tecido para realizar observações morfológicas e análises quantitativas de base. Este protocolo permite o estudo de regeneração do músculo esquelético aguda in vivo de um modo altamente reprodutível 10.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais para a pesquisa animal e aprovado pelo Departamento de Saúde Pública, Saúde Animal, Nutrição e Segurança Alimentar do Ministério da Saúde italiano, em conformidade com a lei sobre a experimentação animal. procedimentos deslocamento cervical podem variar de instituição para instituição com base em IACUC ou seus requisitos equivalentes. 1. Injection cardiotoxina no músculo tibial anterior Prepa…

Representative Results

H & E coloração permite uma avaliação da morfologia do processo de regeneração em pontos de tempo específicos durante a regeneração do músculo esquelético. A Figura 3 mostra o decurso de tempo de análise realizada em músculos TA feridas de ratinhos do tipo selvagem. Músculos foram isolados em 3, 7, 15 e 30 dias após a injecção CTX, como esquematizado na Figura 3A. Representativos de imagens de secções transversais de H & E-cora…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir lesão aguda no músculo esquelético (ou seja, a injeção intramuscular de CTX). É amplamente utilizado como uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de regeneração do músculo esquelético in vivo. CTX injecção induz a degeneração das fibras musculares, que é causada pela despolarização do sarcolema e a contracção das fibras 12, e desencadeia a cascata de eventos que conduz à regeneração muscular. Os músculos esqueléti…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.

Materials

Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica SIGMA ALDRICH C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml BD 324826
Tragacanth Gum MP BIOMEDICALS,LLC 104792
2-Methylbutane (Isopentane) SIGMA ALDRICH 78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat Bio-optica  05-9801
Feather Microtome Blade S35 Bio-optica  01-S35
Glass Slide Superfrost Plus Menzel-Gläser 09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps  2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15024-10
Scissors Noyes Straight 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 14094-11
Eukitt Bio-optica 09-00100
Slide Coverslip BIOSIGMA VBS651
Xylene SIGMA ALDRICH 214736
Ethanol 100% sigma-Aldrich 02860-2.5L
Hematoxyline J.T. BAKER 3873
Eosin SIGMA ALDRICH HT110116
Cryostat LEICA CM3050 S

Referências

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Citar este artigo
Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).

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