Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.
In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.
De fleste dyr er stærkt afhængige deres kemiske sanser til at interagere med deres omgivelser. Lugtesansen spiller en afgørende rolle for at finde og vurdere mad, undgå rovdyr og finde egnede parring partnere. I de fleste pattedyr, den olfaktoriske system består af mindst fire anatomisk og funktionelt forskellige perifere delsystemer: den vigtigste lugteepitel 1,2, den Grueneberg ganglion 3,4, den septale organ Masera 5,6 og vomeronasale organ. Den VNO omfatter perifer sensorisk struktur af tilbehøret olfaktoriske system, (AOS), som spiller en stor rolle i at afsløre kemiske signaler, der formidler oplysninger om identitet, køn, social rang og seksuel tilstand 7-10. VNO er placeret i bunden af næseskillevæggen ret ovenfor ganen. Hos mus er det en bilateral blind-ending rør indesluttet i en bruskagtig kapsel 11-13. Orglet består af både en halvmåneformet medial sensorisk epitheTrifolium, som huser de VSNs og er af ikke-sensorisk del på den laterale side. Mellem begge epiteler ligger en mucus-fyldte hulrum, som er forbundet til næsehulen via den smalle vomeronasal kanalen 14. En stor lateral blodkar i den ikke-sensoriske væv tilvejebringer en vaskulær pumpemekanisme for at lette optagelse af relativt store, for det meste ikke-flygtige molekyler, såsom peptider eller små proteiner i VNO lumen gennem undertryk 15,16. De strukturelle komponenter i VNO er til stede ved fødslen, og orglet når voksenstørrelse kort før puberteten 17. Men om gnaver AOS er allerede funktionel i unge er stadig genstand for debat 18-20.
VSNs udmærker sig ved både deres epitel placering og typen af receptor de udtrykker. VSNs viser en bipolær morfologi med en ikke-myelinerede axon og en enkelt apikal dendritceller, der rager mod lumen og ender i en microvillous dendritisk knop. VSN økseons fasciculate at danne vomeronasal nerve, der forlader bruskspidserne kapsel på dorso-caudale ende, stiger langs septum, passerer cribriform plade og projekter til tilbehøret lugtekolben (AOB) 21,22. Den vomeronasale sensoriske epithel består af to lag: den apikale lag er placeret tættere på den luminale side og havne både V1R- og alle undtagen én type FPR-RS-udtrykkende neuroner. Disse neuroner co-udtrykke G-protein α-subunit G αi2 og projekt til den forreste del af AOB 23-25. Sensoriske neuroner beliggende i de mere basale lag udtrykkelige V2Rs eller FPR-RS1 sammen G αo og sende deres axoner til den bageste region af AOB 26-28.
Vomeronasal neuroner sandsynligvis aktiveres af temmelig små semiochemicals 29-33 (V1Rs) eller proteinholdige forbindelser 34-38 (V2Rs), der udskilles i forskellige kropsvæsker såsom urin, spyt og tårevæske 37,39-41 </sup>. In situ eksperimenter har vist, at VSNs også aktiveres af formyleret peptider og forskellige antimikrobielle / inflammation forbundne forbindelser 25,42. Desuden udtrykte heterologt FPR-rs proteiner deler agonist spektre med FPRs udtrykt i immunsystemet, hvilket indikerer en potentiel rolle som detektorer for sygdom i artsfæller eller forkælede fødekilder 25 (se referere 43).
Grundlæggende for forståelsen receptor-ligand relationer og downstream signalering kaskader i bestemte VSN befolkningsgrupper er en detaljeret evaluering af deres grundlæggende biofysiske karakteristika i en indfødt miljø. I fortiden, har analysen af cellulære signalering stærkt nydt godt af genmodificerede dyr, der markerer en defineret population af neuroner ved at co-udtrykke en fluorescerende markør protein 30,44-49. I denne protokol, en transgen mus linje, der udtrykker FPR-RS3 sammen med en fluorescerende markør (FPR-RS3-i-Venus) anvendes.Denne tilgang eksemplificerer, hvordan at ansætte sådan en genetisk modificeret musestamme til at udføre elektrofysiologiske analyse af et optisk identificerbare cellepopulation anvendes enkelt neuron patch-clamp optagelser i akutte koronale VNO væv skiver. Et lufttryk drevet multi-tønde perfusion for sensoriske stimuli og farmakologiske agenter giver hurtig, reversibel og fokal neuronal stimulation eller hæmning under optagelserne. Whole-celle optagelser i slice præparater mulighed for en detaljeret analyse af iboende egenskaber, spænding-aktiverede konduktanser, samt action potentielle udledning mønstre i cellens oprindelige miljø.
Den VNO er en chemosensory struktur, der registrerer semiochemicals. Til dato er de fleste af vomeronasal receptorer mangler at blive deorphanized som kun få receptor-ligand-par er blevet identificeret. Blandt disse blev V1rb2 beskrevet for specifikt aktiveres af den mandlige urin feromon 2-heptanon 30, der V2rp5 aktiveres af den mandlige specifikke feromon ESP1 57 samt V2r1b og V2rf2 at blive aktiveret af MHC-peptider SYFPEITHI 48 og SEIDLILGY 58, henholdsvis. En forud…
The authors have nothing to disclose.
We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.
Chemicals | |||
Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Surgical tools and consumables | |||
Large petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
Small petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
Water bath | Memmert | WNB 45 |