Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.
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Artigo de método
A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral
Neste artigo
Resumo
Resumo
gravações electrofisiológicos a partir de fatias de medula espinal têm provado ser uma técnica valiosa para investigar um grande número de questões, a partir de propriedades da rede celular. Mostramos como preparar fatias oblíquas viáveis da medula espinhal de ratos jovens (P2 - 11). Nesta preparação, os motoneurónios reter os seus axónios que sai das raízes ventrais da medula espinal. A estimulação desses axônios provoca back-propagação potenciais de ação que invadem o somas motoneurônio e emocionantes garantias do motoneurônios na medula espinhal. Gravação de potenciais de ação antidrômicos é uma forma imediata, definitiva e elegante para caracterizar a identidade motoneurônio, que supera outros métodos de identificação. Além disso, estimular as garantias de neurónios motores é uma maneira simples e confiável para excitar os alvos colaterais dos neurónios motores na medula espinhal, como outros neurónios motores ou Renshaw células. Neste protocolo, apresentamos gravações antidrômicos do motoneurônio somas, bem como excitação celular Renshaw, resultante da estimulação da raiz ventral.
Introdução
Historicamente, as gravações de neurónios motores que utilizam afiado-eléctrodo foram realizadas in vivo em animais de grande porte, tais como gatos ou ratos 1, ou por um conjunto isolado da medula espinal em ratos 2. O surgimento da técnica de gravação de patch-clamp durante os anos 1980, chamado para o acesso directo à motoneurônio somas como a selagem necessária para ser alcançado sob a orientação visual. Assim, a preparação fatia da medula espinal foi prontamente alcançado desde o início da década de 1990 3. No entanto, a preparação fatia precoce muitas vezes não permitir a estimulação das raízes ventrais. Para o melhor d....
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Protocolo
Os experimentos foram realizados em conformidade com as directivas europeias (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e da legislação francesa, e foram aprovados pelo comitê de ética Paris Descartes University.
1. Spinal Cord Slice Preparação
- Prepare as seguintes soluções diárias ou um dia de antecedência. Se mantida durante a noite, bolha, com 95% de O2 e 5% de CO 2 e manter refrigerado em frascos bem fechados.
- Prepare baixo Na + fluido artificial cerebrospinal (ACSF): KCl a 3 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, sacarose 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl
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Resultados
Confirmação do motoneurônio Identidade Usando Potenciais antidrômica Ação
segmentação celular
Os motoneurónios são encontrados no corno ventral (no vermelho visível na Figura 2C). Iniciar a partir do feixe de axônios que formam a raiz ventral e ir até o feixe dispersa totalmente e um começa a ver grandes células (eixo.......
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Discussão
corte oblíquo da medula espinhal é importante uma vez que permite a estimulação unilateral de piscinas de neurónios motores e células de Renshaw em um único segmento vertebral de uma forma fiável, completo e específico. Além disso, ele permite uma identificação rápida, elegante e não-ambígua de neurónios motores gravados. Em seguida, vamos destacar as vantagens desta técnica em comparação com outros métodos de preparação fatia, e depois vamos forçar para fora das armadilhas mais comuns para evitar durante a realização d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer por sua ajuda em tomar as fotografias. Os autores agradecem também Arjun Masukar e Tobias Bock pela revisão do manuscrito. apoios financeiros foram fornecidos pela Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), o NIH-NINDS (R01NS077863), a Fundação Latran Thierry (OHEX Projeto), a associação francesa para miopatia ( número de concessão 16026) e Target ALS é reconhecido agradecimento. Felix Leroy foi o destinatário de um "Contrato de Doutorado" da Ecole Normale Supérieure, Cachan.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolve-se melhor do que outras marcas |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4Sigma | P5655 | ||
| sacarose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Qualidade Biológica | 351-033-721 | |
| glicose | Ácido | G5767 | |
| Sigma | A5960 | ||
| Na-piruvato | Sigma | P2250 | |
| K-gluconato | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Ágar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| ácido glucônico | Sigma | G1951 | |
| Solução de hidróxido de césio | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas - 2.5mm | FST | 15000-08 | só pode ser usado para cortar a dura-máter, pode ser danificado se cortar ossos |
| Estimulador | A-M Systems | Modelo 2100 | |
| Vibratome | Campden | Micrótomo Vibratório 7000 - Modelo 7000smz-2 |
Referências
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J.
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Reimpressões e permissões
