Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell
Summary
Fettgewebe Stammzellen (ASC) leicht zu isolieren und aus dem Fett von normalen Ratten geerntet. ASC Blätter können mit Handy-Blatt Engineering erstellt werden und können in Zucker Diabetiker fetthaltige Ratten ausstellenden voll-dicke Haut Mängel mit freiliegenden Knochen und dann bedeckt mit einem Bilayer künstlicher Haut transplantiert werden.
Abstract
Künstlicher Haut erzielt erhebliche therapeutische Ergebnisse in der klinischen Praxis. Jedoch können künstliche Hautbehandlungen für Wunden bei diabetischen Patienten mit behindert Blutfluss oder große Wunden verlängern. Zellbasierte Therapien erschienen als eine neue Technik für die Behandlung von diabetischen Geschwüren und Zelle-Blatt-Technik verbessert die Wirksamkeit der Zelltransplantation. Eine Reihe von Berichten haben vorgeschlagen, dass Fettgewebe Stammzellen (ASC), eine Art mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC), therapeutisches Potenzial aufgrund ihrer relativen Fülle in Fettgewebe und ihre Zugänglichkeit für die Sammlung im Vergleich zu MSCs aus anderen Geweben zeigen. Daher erscheinen ASC eine gute Quelle für Stammzellen für therapeutische Zwecke. In dieser Studie wurden ASC Blätter aus dem epididymal Fettgewebe Fett von normalen Lewis Ratten mit Temperatur-responsive Kultur Gerichte und normalen Kulturmedium mit Ascorbinsäure erfolgreich erstellt. Die ASC-Blätter wurden in Zucker Diabetes Fettsäuren (ZDF) Ratten verpflanzt, einem Rattenmodell von Typ-2-Diabetes und Adipositas, die verminderte aufweisen Wundheilung. Eine Wunde auf der hinteren kranialen Oberfläche erstellt wurde, ASC Blätter wurden in der Wunde verpflanzt und einem Bilayer Kunsthaut wurde verwendet, um die Blätter zu decken. ZDF-Ratten, die ASC Blätter erhalten hatte besser als ZDF Ratten ohne die Transplantation von ASC Blätter Wundheilung. Dieser Ansatz war begrenzt, da ASC Blätter empfindlich gegen Trockenheit sind, erfordert die Aufrechterhaltung eines feuchten Wundmilieus. Daher wurde Kunsthaut verwendet, um das ASC-Blatt, um Austrocknen zu verhindern, dass zu decken. Die allogene Transplantation von ASC-Blatt in Kombination mit künstlicher Haut könnten auch für andere hartnäckigen Geschwüren oder Verbrennungen, wie Sie mit peripheren arteriellen Verschlusskrankheit und Kollagen-Krankheit beobachtet und könnte für Patienten, die unterernährt sind oder Steroide verwenden verabreicht werden. Somit wäre diese Behandlung der erste Schritt zur Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten für Diabetiker, die Wunde heilen.
Introduction
Die Bevölkerung von Diabetes-Patienten steigt weltweit und 400 Millionen in 20151erreicht; schätzungsweise 15-25 % der Patienten mit Diabetes sind durch das Fortschreiten der unteren Extremität diabetische Geschwüre2gefährdet. Untere Extremität diabetische Geschwüre sind unlösbar und therapeutische längere mit Aufbautraining nach der vollständigen Wiederherstellung erfordern möglicherweise. Periode oft lange Therapie führt zu einem deutlichen Rückgang der Lebensqualität von Patienten. So müssen neue Therapien, die zu verringern oder zu vermeiden Ärger für die Behandlung von diabetischen Wunden entwickelt werden. Um diabetische Wundheilung zu bewerten, haben wir ein diabetisches Geschwür Wundheilung Modell bei Ratten, die praktische klinischen Bedingungen imitiert, optimiert und bewertet ob Umpflanzen Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) Blätter mit Zelle-Blatt Technik beschleunigt die Wundheilung.
Mesenchymale Stromazellen Zellen (MSCs) weisen ein ausgezeichnetes Potenzial zur Beschleunigung der Wundheilung aufgrund ihrer Selbsterneuerung Kapazität, ihre immunmodulatorische Wirkung und ihre Fähigkeit, sich in verschiedenen Zelle Linien3differenzieren. ASC sind eine Art von MSC abgeleitet aus Fettgewebe, und sie weisen mehrere Vorteile gegenüber MSCs aus anderen Geweben, einschließlich ihrer potenziellen angiogenen und parakrine Aktivität4,5abgeleitet. Fettgewebe ist relativ häufig in den menschlichen Körper und seine Zugänglichkeit ermöglicht Sammlung mit minimal-invasiven Verfahren. Daher wurden ASCs experimentell für Wundheilung Anwendungen6,7verwendet.
Frühere Berichte haben gezeigt, dass die direkte Einspritzung von einzelligen MSC Suspensionen in Bereiche um Wunden8,9der Wundheilung beschleunigen kann. Trotz Berichte der Beschleunigung der Wundheilung in diabetische Geschwüre Modelle nach der Injektion von einzelligen Suspensionen ist die Überlebenszeit der transplantierten Zellen an der Wundstelle jedoch nicht klar.
In dieser Studie haben wir Zelle-Blatt Engineering mit Temperatur-responsive Kultur Gerichten angewandt. Diese Gerichte haben die Temperatur-responsive Polymer N– Isopropylacrylamide auf ihrer Oberfläche10kovalent gebunden. Die veredelten Polymerschicht ermöglicht temperaturgeführte Zelladhäsion, oder Loslösung von der Oberfläche der Kulturschale. Die Oberfläche der Schale wird bei 37 ° C, so dass Zellen zu halten und vermehren, während Zellen spontan von der Oberfläche zu lösen, wenn sie bei Temperaturen unter 32 ° c hydrophile wird hydrophob Kultivierte Zellen geerntet werden können, als ein zusammenhängender Zelle Blatt mit intakten Zell-Zell-Verbindungen und extrazellulären Matrizen (ECMs) einfach durch Absenken der Temperatur; so sind proteolytische Enzyme, die die ECM wie Trypsin, schädigen nicht erforderlich11. Daher kann Zelle-Blatt Engineering Zell-Zell-Verbindungen erhalten und verbessern die Wirksamkeit der Zelltransplantation.
Darüber hinaus erhöht die Zelle-Blatt Transplantation Zelle Überlebensrate im Vergleich zu Zelle Injektion12. In diesem Protokoll wurden Zucker zuckerkranke fetthaltige (ZDF) Ratten als Typ 2 Diabetes und Adipositas Modell mit verzögerter Wundheilung ausgewählt. ZDF-Ratten entwickeln spontan Übergewicht ca. 4 Wochen. Dann entwickeln sie Typ-2-Diabetes mit Fettleibigkeit zwischen 8 und 12 Wochen alt, an welcher Stelle sie Hyperglykämie Zusammenhang mit Insulin-Resistenz, Dyslipidämie und Hypertriglyceridämie13aufweisen. Verzögerte Wundheilung, verminderte Blutzufuhr in peripheren Blutgefäße und diabetische Nephropathie sind auch14,15,16beobachtet. Darüber hinaus möglicherweise ZDF Ratten ein geeignetes Modell für das Studium, die Heilung von hartnäckigen kutanen Geschwüren, wie z. B. diabetische Geschwüre.
Die Unterschiede zwischen Mensch und Nagetiere in Wundheilung Mechanismen sind anatomische Unterschiede in der Haut zugeordnet. Wundheilung bei normalen Ratten basiert auf Wunde Kontraktion, während Wundheilung beim Menschen auf erneute Epithelisierung und Granulationsgewebe Bildung beruht. In der Regel Wunde Schienung in Nager-Modelle verwendet Wunde Kontraktion zu minimieren und für die allmähliche Bildung von Granulationsgewebe17, obwohl Wunden in nondiabetic Ratten durch Kontraktion fast vollständig geschlossen sind. Doch Diabetiker Wunde Kontraktion im ZDF Ratten beeinträchtigt, und vor allem der Wundheilung erfolgt durch erneute Epithelisierung und Bildung von Granulationsgewebe; Somit ist dieser Prozess ähnlicher menschlichen Wundheilung14.
Diabetische Wunden mit freiliegenden Knochen nach Debridement sind klinisch oft anzutreffen. Frühere Studien haben 12 mm Durchmesser voll-dicke Hautwunden auf dem Rücken der Athymic nackte Mäuse18,19 und 10 mm Durchmesser voll-dicke Hautwunden auf dem Rücken von normalen Mäusen20untersucht. Um einen klinischen Modell für schwere diabetische Wunden entwickeln, größere (15 x 10 mm2) voll-dicke Hautdefekte mit Knochen ausgesetzt und ohne das Periost erstellt wurden, als zuvor beschriebenen21in Ratten mit Typ-2-Diabetes und Adipositas.
Ratte ASC (rASC) Blätter aus der ASC von normalen Lewis-Ratten wurden durch die allogene Transplantation von ASC Blätter erstellt. In der klinischen Praxis ist autologe Transplantation nicht realisierbar, weil Diabetes-Patienten mit Geschwüren zeigen oft schwere diabetische Komplikationen, wie unkontrollierte hohe Blutzuckerwerte und hohen Body-mass-Indizes und diese Komplikationen Ursache Wundheilung Störungen, die die Schwierigkeit Fettgewebe von diesen Patienten zu erhöhen. Darüber hinaus ASCs von Tieren mit Diabetes Ausstellung Eigenschaften verändert und beeinträchtigt die Funktion22. Deshalb beschreibt das Protokoll hier vorgestellten der allogenen Transplantation rASC Blätter aus normalen Ratten und die Anwendung von künstlicher Haut an diabetischen Ratten.
Die Bilayer künstliche Haut in diesem Protokoll verwendeten verhindert, dass die spontane Kontraktion der Wunden, fördert die Synthese einer neuen Bindegewebe Matrix und ähnelt der wahre Lederhaut23. In diesem Protokoll ist künstlicher Haut auf eine rASC Blatt platziert und mit Nylonfäden zur Verhinderung von Wunde Kontraktion oder Erweiterung aus losen Rattenhaut fixiert. Darüber hinaus die künstliche Haut bietet einen dreidimensionalen Rahmen für die ASC-Blätter, unterhält eine feuchte Umgebung für die transplantierten ASC Bettwäsche und Wunden und schützt die Wunden vor Infektionen und externe Kräfte. Schließlich ist ein nicht klebendes Verband gelegt, über die Wunde vor äußeren Einwirkungen schützen, pflegen ein feuchtes Wundmilieu und Exsudat aufnehmen.
Ein rASC-Blatt ist dünn, flexibel und verformbar und Verschieben von Empfänger Websites, wie z. B. ein schlagendes Herz24eingehalten werden kann. Zelle-Blatt für die Rekonstruktion der verschiedenen Geweben verwendet worden und erzeugen Heilwirkungen25,26. ASC-Blätter, die klinische therapeutisches Potenzial aufweisen könnte beschleunigen die Heilung von vielen Arten von Wunden. Darüber hinaus die allogene Transplantation von ASC Blätter, kombiniert mit dem Einsatz von künstlicher Haut, möglicherweise für die Behandlung von hartnäckigen Geschwüren oder Verbrennungen, z. B. bei der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit oder Kollagen-Krankheit, oder sie können verabreicht werden, um Patienten, die unterernährt sind oder Steroide verwenden. Dieser Ansatz erhöht die Effizienz der Transplantation ASC. Wundheilung ZDF Rattenmodell produziert eine schwere Wunde Erkrankung, die ähnelt die menschlichen Wundheilung und klinische Bedingungen in einem kleinen Versuchstier imitiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischsten Schritte für das züchten erfolgreich eine rASC Blatt sind wie folgt: 1) die Temperatur bei etwa 37 ° C während der Kultivierung auf Temperatur reagierende Kultur Gerichte beibehalten werden. Während der Erstellung eines Blattes rASC jedes Verfahren durchgeführt wurde, auf einem 37 ° C Thermo-Teller und jedes Reagenz wurde auf 37 ° C zu verhindern, dass Zellen spontan aus der Schale31abnehmen gewärmt. (2) die Empfänger ZDF Ratten müssen überwacht werden, um die Entfernu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Yukiko Koga der Abteilung für plastische und Rekonstruktionschirurgie, Juntendo University School of Medicine, für die praktische Beratung. Wir danken auch Herrn Hidekazu Murata der diabetischen Center of Tokyo Women Medical University School of Medicine für ausgezeichneten technischen Support. Diese Studie wurde unterstützt durch die Schaffung von Innovationszentren für erweiterte interdisziplinäre Bereiche Forschungsprogramm des Projekts für Entwicklungsländer Innovationssysteme “Zelle Blatt Tissue Engineering Center (CSTEC)” vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referências
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
