Oprettelse og Transplantation af et fedtholdigt-afledte stamceller (ASC) ark i en diabetisk sårheling Model
Summary
Fedt-afledte stamceller (ASCs) er let isoleret og høstet fra fedt af normale rotter. ASC ark kan oprettes ved hjælp af celle-ark engineering og kan blive transplanteret ind i Zucker diabetisk fede rotter udviser fuld-tykkelse hud mangler med udsatte knogle og derefter dækket med et dobbeltlag af kunstigt hud.
Abstract
Kunstig hud har opnået betydelige terapeutiske resultater i klinisk praksis. Men kunstig hudbehandlinger for sår i diabetisk patienter med hindret blodgennemstrømning eller med store sår kan forlænges. Celle-baserede behandlinger er dukket op som en ny teknik til behandling af diabetisk sår, og celle-ark engineering har forbedret effekten af celle transplantation. En række rapporter har antydet, at fedt-afledte stamceller (ASCs), en type mesenchymale stromale celler (MSC), udviser terapeutiske potentiale på grund af deres relativ overflod i fedtvæv og deres tilgængelighed for indsamling sammenlignet med MSCs fra andre væv. Derfor synes ASCs at være en god kilde til stamceller til terapeutisk brug. I denne undersøgelse, blev ASC ark fra epididymis fedtaflejringer af normale Lewis rotter oprettet ved hjælp af temperatur-responderende kultur retter og normal næringssubstratet indeholdende ascorbinsyre. ASC ark blev transplanteret ind i Zucker diabetisk fedtsyrer (ZDF) rotter, en rotte model af type 2 diabetes og fedme, der udviser formindsket sårheling. Et sår blev oprettet på den bageste kranielle overflade, ASC ark blev transplanteret ind i såret og en tolagede kunstig hud blev brugt til at dække arkene. ZDF rotter, der fik ASC plader havde bedre sårheling end ZDF rotter uden transplantation af ASC ark. Denne fremgangsmåde var begrænset, fordi ASC plader er følsomme over for tørre forhold, der kræver vedligeholdelse af en fugtig sår miljø. Derfor, kunstig hud blev brugt til at dække ASC ark for at forhindre udtørring. Allogen transplantation af ASC plader i kombination med kunstig hud kan også gælde for andre vanskelige sår eller forbrændinger, som de observerede med perifer arteriel sygdom og kollagen sygdom, og kan gives til patienter, der er underernærede eller bruger steroider. Denne behandling kan således være det første skridt mod at forbedre de terapeutiske muligheder for diabetisk sår healing.
Introduction
Befolkningen i diabetisk patienter er stigende på verdensplan og nåede 400 millioner i 20151; en anslået 15-25% af patienter med diabetes er i fare fra progression af en lavere-ekstremitet diabetisk sår2. Lavere-ekstremitet diabetisk sår er genstridig og kan kræve en langvarig terapeutiske periode med rehabilitering træning efter fuldstændig helbredelse. En lang terapi periode ofte resulterer i en betydelig reduktion i patienternes livskvalitet. Således, nye behandlingsformer, at mindske eller forhindre forværring skal udvikles til behandling af diabetiske sår. For at evaluere diabetisk sårheling, vi optimeret en diabetisk sår sår-heling model i rotter, som efterligner praktiske kliniske tilstande, og vurderet om omplantning fedtholdigt-afledte stamceller (ASC) ark ved hjælp af celle-ark engineering accelereret sårheling.
Mesenchymale stromale celler (MSCs) udviser en fremragende potentiale for fremskyndelse af sårheling på grund af deres selvfornyelse kapacitet, deres immunmodulerende effekter og deres evne til at differentiere i forskellige celle lineages3. ASCs er en type af MSC stammer fra fedtvæv, og de udviser flere fordele i forhold til MSCs stammer fra andre væv, herunder deres angiogene potentielle og paracrine aktivitet4,5. Fedtvæv er relativt rigeligt i den menneskelige krop og dens tilgængelighed giver mulighed for samling ved hjælp af minimalt invasive procedurer. Derfor er ASCs anvendt eksperimentelt for sårheling programmer6,7.
Tidligere rapporter har vist, at den direkte indsprøjtning af encellede MSC suspensioner i områderne omkring sår kan fremskynde sårheling8,9. Trods rapporter om fremskyndelse af sårheling i diabetisk sår modeller efter injektion af encellede suspensioner, er overlevelsestid af transplanterede celler på webstedet sår ikke klar.
I denne undersøgelse anvendte vi celle-ark engineering ved hjælp af temperatur-responderende kultur retter. Disse retter har temperatur-responderende polymer N– isopropylacrylamide kovalent bundet op på deres overflade10. Det podede polymer lag giver mulighed for temperatur-kontrollerede celle vedhæftning til eller løsrivelse fra overfladen af kultur parabol. Overfladen af skålen bliver hydrofobe ved 37 ° C, så cellerne til at overholde og formere sig, mens celler frigøre spontant fra overfladen, når det bliver hydrofilt ved temperaturer under 32 ° C. Dyrkede celler kan høstes som en sammenhængende celle ark med intakt celle til celle vejkryds og ekstracellulære matricer (ECMs) blot ved at reducere temperaturen; Proteolytiske enzymer, der skader ECM, såsom trypsin, er således ikke kræves11. Derfor, celle-ark engineering kan bevare celle til celle forbindelser og forbedre effektiviteten af celle transplantation.
Derudover øger celle-ark transplantation celle overlevelseschancerne i forhold til celle indsprøjtning12. I denne protokol, blev Zucker diabetisk fede (ZDF) rotter valgt som en type 2 diabetes og fedme model med Forsinket sårheling. ZDF rotter udvikle spontant fedme på ca. 4 uger. De derefter udvikler type 2-diabetes med fedme mellem 8 og 12 ugens i alder, på hvilket tidspunkt de udviser hyperglykæmi forbundet med insulin resistens, dyslipidæmi og hypertriglyceridæmi13. Forsinket sårheling, nedsat blodgennemstrømning i perifere blodkar og diabetisk nefropati er også observeret14,15,16. ZDF rotter kan derudover være en passende model til at studere heling af genstridig kutant sår, såsom diabetisk sår.
Forskelle mellem mennesker og gnavere i sårheling mekanismer er forbundet med anatomiske forskelle i huden. Sårheling hos normale rotter er baseret på såret sammentrækning, sårheling hos mennesker bygger paa ny epithelialization og granulationsvæv dannelse. Typisk, sår fiksering bruges i gnavere modeller hjælper med at minimere sår sammentrækning og giver mulighed for den gradvise dannelse af granulationsvæv17, selv om sår i diabetiske rotter er næsten helt lukket af sammentrækning. Dog diabetisk sår sammentrækning i ZDF rotter er nedsat, og sårheling primært sker gennem re epithelialization og granulationsvæv dannelse; denne proces er således mere ligner menneskelige sårheling14.
Diabetisk sår med udsatte ben efter debridering er ofte stødt på klinisk. Tidligere studier har undersøgt 12-mm diameter fuld-tykkelse hud sår på ryggen af athymiske nøgen mus18,19 , og 10-mm diameter fuld-tykkelse hud sår på ryggen af normale mus20. For at udvikle en klinisk model for svær diabetisk sår, større (15 x 10 mm2) fuld-tykkelse hud mangler med udsat knogle og uden periosteum blev skabt, som tidligere beskrevet21, i rotter med type 2 diabetes og fedme.
Rotte ASC (rASC) plader fra ASCs af normale Lewis rotter blev skabt gennem allogen transplantation af ASC ark. I klinisk praksis er autolog transplantation uigennemførlig, fordi diabetisk patienter med sår ofte udviser alvorlige diabetiske komplikationer, såsom ukontrolleret højt blodsukker og høje body mass indeks og disse komplikationer årsag sårheling lidelser, der øger vanskeligheden ved at opnå fedtvæv fra disse patienter. Derudover ASCs fra dyr med diabetes udstille ændret egenskaber og nedsat funktion22. Protokollen præsenteres her beskrives derfor, allogen transplantation af rASC plader fra normale rotter og anvendelsen af kunstigt hud til diabetisk rotter.
Tolagede kunstige huden bruges i denne protokol forhindrer den spontane sammentrækning af sår, fremmer syntesen af en ny bindevæv matrix og ligner ægte dermis23. I denne protokol, er kunstig hud placeret på en rASC ark og fast med nylon tråde at forhindre sår sammentrækning eller udvidelsen som følge af løs rotte hud. Derudover kunstig hud giver en tredimensionel ramme for ASC ark, opretholder et fugtigt miljø for de transplanterede ASC plader og sår, og beskytter sårene fra infektion og ydre kræfter. Endelig, en ikke-klæbende dressing er placeret over såret til at beskytte den fra eksterne virkninger, opretholder et fugtigt sår miljø og absorbere ekssudat.
En rASC ark er tynde, fleksible og deformerbare og kan overholdes flytte modtageren steder, såsom en bankende hjerte24. Celle-ark engineering har været brugt til genopbygning af forskellige væv og kan generere helbredende virkninger25,26. ASC ark, der udviser kliniske terapeutiske potentiale kan fremskynde heling af mange typer af sår. Derudover allogen transplantation af ASC ark, kombineret med brugen af kunstig hud, kan anvendes til behandling af vanskelige sår eller forbrændinger, som dem, der observeres i perifer arteriel sygdom eller kollagen sygdom, eller de kan administreres til patienter, der er underernærede eller bruger steroider. Denne metode øger effektiviteten af omplantning ASCs. Sårheling ZDF rotte model producerer en alvorlig såret tilstand, som ligner den menneskelige sårheling proces og efterligner kliniske tilstande i en små eksperimentelle dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trin til vellykket dyrkning en rASC ark er som følger: 1) temperaturen holdes på cirka 37 ° C under dyrkning på temperatur-responderende kultur retter. Under oprettelsen af en rASC ark hver procedure blev udført på en 37 ° C thermo-plade, og hver reagens blev opvarmet til 37 ° C at forhindre cellerne i spontant afmontering fra fad31. 2) de modtagende ZDF rotter skal overvåges for at forhindre fjernelse af ikke-klæbende dressing, som er afgørende for en vellykket transpl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Dr. Yukiko Koga afdeling af plast og rekonstruktionskirurgi, Juntendo University School of Medicine, for at give praktiske råd. Vi takker også Mr. Hidekazu Murata af den diabetiske Center af Tokyo Women’s Medical University School of Medicine for fremragende teknisk support. Denne undersøgelse blev støttet af oprettelsen af Innovation Centre for avanceret tværfaglig forskning områder Program af projekt for udviklingslandene innovationssystemer “celle ark Tissue Engineering Center (CSTEC)” fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referências
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
