एक उच्च Throughput, मल्टिप्लेक्स और लक्षित प्रोटिओमिक सीएसएफ परख Neurodegenerative Biomarkers और apolipoprotein ई isoforms स्थिति यों
Summary
हम एक उच्च throughput, मल्टीप्लेक्स, और लक्षित प्रोटिओमिक मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) परख नैदानिक अनुवाद के लिए क्षमता के साथ विकसित का वर्णन है। परीक्षण ऐसे apolipoprotein ई वेरिएंट (E2, E3 और इ 4) के रूप में neurodegeneration के लिए संभावित मार्करों और जोखिम वाले कारकों, quantitate, और उनके allelic अभिव्यक्ति उपाय कर सकते हैं।
Abstract
कई neurodegenerative रोगों अभी भी प्रभावी उपचार कमी कर रहे हैं। की पहचान करने और इन रोगों को वर्गीकृत करने के लिए विश्वसनीय बायोमार्कर भविष्य उपन्यास उपचारों के विकास में महत्वपूर्ण होगा। अक्सर संभावित नए बायोमार्कर उनके विकास और उच्च लागत में सीमाओं के कारण क्लिनिक में यह नहीं बनाते हैं। हालांकि, लक्षित एकाधिक रिएक्शन मॉनिटरिंग तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर का उपयोग कर प्रोटिओमिक्स / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस), विशेष रूप से, ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर एक तरीका है कि तेजी से मूल्यांकन और नैदानिक प्रयोगशालाओं में नैदानिक अनुवाद के लिए बायोमार्कर मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परंपरागत रूप से, इस मंच नैदानिक प्रयोगशालाओं में छोटे अणुओं की माप के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह संभावित प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए है, कि यह बनाता है एलिसा (एंजाइम से जुड़ी Immunosor लिए एक आकर्षक विकल्पतुला हुआ परख) आधारित तरीकों। हम यहाँ वर्णन कैसे लक्षित प्रोटिओमिक्स मनोभ्रंश का मल्टिप्लेक्स मार्कर, का पता लगाने और ज्ञात जोखिम कारक ई isoform 4 (ApoE4) apolipoprotein के quantitation सहित मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
आदेश में अनुवाद के लिए परख उपयुक्त बनाने के लिए, यह तेजी से सरल, अत्यधिक विशिष्ट हो सकता है और लागत प्रभावी करने के लिए बनाया गया है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, परख के विकास में हर कदम व्यक्तिगत प्रोटीन और ऊतकों वे में विश्लेषण कर रहे हैं के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस पद्धति का अनुवाद के लिए एक लक्षित प्रोटिओमिक्स एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस के विकास के लिए विभिन्न सुझावों और ट्रिक सहित एक विशिष्ट कार्यप्रवाह का वर्णन ।
विधि विकास tryptic quantotypic पेप्टाइड्स, जो पता लगाने के लिए एमएस जांचना का रिवाज संश्लेषित संस्करणों का उपयोग कर अनुकूलित है और फिर सीएसएफ में नुकीला chromatographic जुदाई एमएस में विश्लेषण करने से पहले में अंतर्जात पेप्टाइड की सही पहचान निर्धारित करने के लिए। Absolu प्राप्त करने के लिएते quantitation, लघु अमीनो एसिड अनुक्रम टैग और एक trypsin दरार साइट युक्त के साथ पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक संस्करणों, परख में शामिल किए गए हैं।
Introduction
अल्जाइमर रोग, Lewy शरीर पागलपन और पार्किंसंस रोग, के रूप में neurodegenerative रोगों के बढ़ते प्रभाव के कई देशों 1 में एक सामाजिक आर्थिक मुद्दा बनता जा रहा है। अतिरिक्त बायोमार्कर कि पहचान करने और रोग की प्रारंभिक अवस्था में रोगियों को वर्गीकृत, और किसी भी संभावित नए उपचार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एक की जरूरत है। इस विधि के समग्र लक्ष्य neurodegeneration की क्षमता सीएसएफ मार्कर मान्य करने के लिए एक, सुव्यवस्थित आर्थिक और तेजी से रास्ते के लिए एक सामान्य पाइपलाइन बनाने के लिए है। तर्क यह एक आसानी से संशोधनीय विधि के रूप में लक्षित प्रोटिओमिक्स या पेप्टाइड एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस का उपयोग करने की खोज के प्रयोगों से कई संभावित प्रोटीन बायोमार्कर का आकलन करने के लिए है। ये आगे एक तेजी से chromatographic जुदाई (<10 मिनट) और मूल्यांकन के ऊपर मल्टिप्लेक्स जा सकता है। neurodegenerative बायोमार्कर के लिए इस मल्टीप्लेक्स स्क्रीन के भीतर, हम जानते मनोभ्रंश जोखिम कारक apolipoprotein isoform इ 4 (ApoE4) को शामिल किया है तो हम can एक साथ अपनी स्थिति और अभिव्यक्ति के स्तर पर, तय है कि अलग जीनोटाइपिंग परीक्षण 2 के लिए आवश्यकता को नष्ट करने के द्वारा। नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस नियमित तौर पर सही तरह के एलिसा या radioimmunoassay (रिया) के रूप में अन्य तरीकों पर छोटे अणुओं quantitating के लिए पसंद की विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है। विश्लेषण करने के प्रोटीन के लिए एमएस प्रौद्योगिकी के उपयोग में यह बदलाव, इम्युनो आधारित प्रौद्योगिकियों के साथ मुद्दों को प्रेरित मुख्य रूप से किया गया है। ये पार विशिष्टता, बैच बैच बदलाव के लिए, सीमित शैल्फ जीवन है, और उच्च लागत शामिल है। इसलिए, लक्षित प्रोटिओमिक्स तेजी से इस तरह पश्चिमी सोख्ता, रिया और एलिसा के रूप में एंटीबॉडी आधारित तरीकों के लिए एक से बढ़ विकल्प बनता जा रहा है। हालांकि, एक परख में कई मार्करों मल्टीप्लेक्स करने की क्षमता इम्युनो आधारित विधियों 3 पर इस तकनीक का बड़ा फायदा है। तकनीक कई ऊतकों के लिए लागू है और प्लाज्मा 4 और मूत्र 5,6 सहित कई प्रोटिओमिक्स के अध्ययन के लिए एक मान्यता रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
जीवन दर्शनchnique ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने में उपयोग और विशेषज्ञता है कि किसी भी प्रयोगशाला के लिए लागू किया जा सकता है। पेप्टाइड डिजाइन खुला स्रोत डेटाबेस के बढ़ते उपयोग के साथ अपेक्षाकृत सरल है। कस्टम पेप्टाइड्स संश्लेषण के प्रतिस्पर्धी बाजार उन्हें बहुत अधिक किफायती बनाता है। भारी पेप्टाइड्स, हालांकि, महंगे हैं और इसलिए मार्कर एक बड़े पैमाने में जाने से पहले एक छोटे से पलटन पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए। वहाँ बढ़ती क्षमता के लिए तकनीक सबसे बड़े अस्पतालों ट्रिपल quadrupole आधारित प्लेटफॉर्म है जो आसानी से निशाना बनाया प्रोटिओमिक assays चलाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता होने के साथ, नैदानिक नैदानिक सेटिंग में इस्तेमाल किया जा रहा है। विधि से एक इस तरह के आवेदन, दिनचर्या नैदानिक सेटिंग में इसे बनाने, सिकल सेल एनीमिया 7 के लिए नवजात शिशु के रक्त जगह स्क्रीनिंग के लिए अपने हाल के आवेदन पत्र है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी एमएस आधारित assays के साथ के रूप में, विधि में महत्वपूर्ण कदम आंतरिक मानकों का उचित और सटीक मात्रा के निर्धारण कर रहे हैं। पूर्ण quantitation इस्तेमाल किया जा रहा है, तो मानक वक्र में नुकीला पेप्टाइड्स की सही मा…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
Referências
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