Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado
Summary
Se describe un alto rendimiento, múltiplex, y el ensayo de líquido cefalorraquídeo proteómica dirigida (CSF) desarrollado con potencial para la traducción clínica. La prueba se puede cuantificar marcadores potenciales y factores de riesgo para la neurodegeneración, tales como las variantes de la apolipoproteína E (E2, E3 y E4), y medir su expresión alélica.
Abstract
Muchas enfermedades neurodegenerativas todavía se carece de tratamientos eficaces. biomarcadores fiables para la identificación y clasificación de estas enfermedades serán importantes en el desarrollo de futuras terapias novedosas. A menudo, los posibles nuevos biomarcadores no llegan a la clínica debido a las limitaciones en su desarrollo y altos costos. Sin embargo, la proteómica dirigidos utilizando monitorización de reacción múltiple Liquid Chromatography-tandem / espectrometría de masas (MRM LC-MS / MS), usando específicamente espectrómetros de masas de triple cuadrupolo, es un método que se puede utilizar para evaluar rápidamente y validar biomarcadores para la traducción clínica en los laboratorios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma se ha utilizado ampliamente para la medición de pequeñas moléculas en laboratorios clínicos, pero es el potencial para analizar las proteínas, que hace que sea una alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked ImmunosorEnsayo de doblado) a base de métodos. Se describe aquí cómo proteómica dirigida se puede utilizar para medir marcadores multiplexados de demencia, incluyendo la detección y cuantificación de lo conocido factor de riesgo apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).
Con el fin de hacer que el ensayo adecuado para la traducción, que está diseñado para ser rápida, simple, altamente específico y rentable. Para lograr esto, cada paso en el desarrollo del ensayo debe ser optimizado para las proteínas individuales y tejidos que se analizan. Este método describe un flujo de trabajo típico que incluye varios consejos y trucos para el desarrollo de una proteómica dirigida MRM LC-MS / MS para la traducción .
El desarrollo del método se optimiza el uso de versiones sintetizadas de encargo de péptidos trípticos quantotypic, que calibran la MS para la detección y luego se disparó en el LCR para determinar la correcta identificación del péptido endógeno en la separación cromatográfica previa al análisis en la MS. Para lograr absoluTe cuantificación, marcadas por isótopos estables versiones estándar interno de los péptidos con aminoácidos corta etiquetas de secuencias de ácido y que contiene un sitio de escisión de tripsina, están incluidos en el ensayo.
Introduction
El impacto creciente de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson, se está convirtiendo en un problema socioeconómico en muchos países 1. Hay una necesidad en biomarcadores adicionales que se pueden utilizar para identificar y clasificar los pacientes en las primeras etapas de la enfermedad, y para supervisar cualquier posible nuevos tratamientos. El objetivo general de este método es la creación de una tubería genérico de una manera ágil, económica y más rápida de validación de posibles marcadores en LCR de la neurodegeneración. La razón es el uso de la proteómica dirigidos o péptido MRM LC-MS / MS como un método fácilmente modificable para evaluar múltiples biomarcadores de proteínas potenciales de los experimentos de descubrimiento. Estos pueden ser multiplexados aún más en una separación rápida cromatográfica (<10 min) y se evaluó. Dentro de esta pantalla múltiplex de biomarcadores neurodegenerativas, hemos incluido la demencia conocido factor de riesgo de la apolipoproteína E4 isoforma (ApoE4), de modo que te pn determinar simultáneamente su estado y nivel de expresión, por que la eliminación de la necesidad de pruebas de genotipo 2 separadas. LC MS / MS se utiliza habitualmente como el método de elección para cuantificar con precisión las pequeñas moléculas a través de otros métodos tales como ELISA o radioinmunoensayo (RIA). Este cambio en el uso de la tecnología EM para el análisis de proteínas, ha sido impulsado principalmente por problemas con las tecnologías basadas en técnicas inmunológicas. Estos incluyen cruz-especificidad, variación entre lotes, la vida útil limitada, y alto costo. Por lo tanto, la proteómica dirigidos está convirtiendo rápidamente en una alternativa cada vez más a los métodos basados en anticuerpos, tales como transferencia Western, RIA y ELISA. Sin embargo, la capacidad de multiplexar muchos marcadores en un ensayo es la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos basados en inmuno 3. La técnica es aplicable a muchos tejidos y se ha utilizado como una estrategia de validación para los estudios de proteómica muchos incluyendo plasma 4 y la orina 5,6.
el technique se puede aplicar a cualquier laboratorio que tiene acceso y experiencia en el uso de espectrómetros de masas de triple cuadrupolo. el diseño de péptidos es relativamente simple, con el creciente uso de las bases de datos de código abierto. El mercado competitivo de la síntesis de péptidos personalizados los hace mucho más asequible. péptidos pesados, sin embargo, son caros y, por tanto, los marcadores deben ser evaluados en una pequeña cohorte antes de trasladarse a una escala mayor. Existe un creciente potencial de la técnica que se utiliza en la configuración de diagnóstico clínico, con la mayoría de los grandes hospitales que tienen plataformas basadas triple cuadrupolo que pueden ser fácilmente adaptados para ejecutar ensayos proteómicos dirigidos. Una de tales aplicaciones del método, por lo que es en el ajuste de diagnóstico de rutina, es su reciente aplicación a la detección de gotas de sangre de recién nacidos para la anemia de células falciformes 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como con todos los ensayos basados en MS, los pasos críticos en el método son la determinación de las cantidades adecuadas y precisas de estándares internos. Si se utiliza la cuantificación absoluta, entonces las cantidades correctas de péptidos de púas en la curva estándar también son críticos.
Nuestro ensayo no requiere la precipitación del CSF o el uso de cualquier tipo de limpias pasos arriba o de desalado antes del análisis MS – se trata de un método de reacción en u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
Referências
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