Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize
Summary
Biz klinik çeviri potansiyeli ile geliştirilen yüksek verim, multipleks ve hedeflenen proteomik beyin omurilik sıvısı (BOS) testi açıklar. Test böyle Apolipoprotein E varyantları (E2, E3 ve E4) olarak nörodejenerasyonun potansiyel belirteçleri ve risk faktörlerini, ölçmek ve onların allelik ifadesini ölçebilirsiniz.
Abstract
Birçok nörodejeneratif hastalıklar hala etkili tedaviler eksiktir. belirlenmesi ve bu hastalıkların sınıflandırılması için güvenilir biyobelirteçler gelecek yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli olacaktır. Genellikle potansiyel yeni belirteç nedeniyle gelişim ve yüksek maliyetlerle kısıtlamalar kliniğe yapmazlar. Ancak, Sıvı Kromatografi-tandem İzleme Çoklu Reaksiyon kullanılarak hedeflenen proteomik / Kütle Spektrometre özellikle üçlü dört kutuplu kütle spektrometre kullanılarak (MRM LC-MS / MS), hızla teşhis laboratuvarları içine klinik çeviri için biyobelirteçleri değerlendirmek ve doğrulamak için kullanılabilecek bir yöntemdir . Geleneksel olarak, bu platform, klinik laboratuarlarda küçük moleküllerin ölçümü için yaygın olarak kullanılmıştır, ama o ELISA (enzim bağlantılı Immunosor için cazip bir alternatif yapar, proteinleri analiz etmek için potansiyelbent Deneyi) yöntemlerini tabanlı. Biz, burada E izoformu 4 (ApoE4) apolipoprotein bilinen bir risk faktörü saptanması ve nicelenmesi bunama birden fazla mesaj gösterge, ölçmek için nasıl kullanılabileceğini hedefli proteomik burada açıklanmaktadır.
Çeviri için deney uygun bir hale getirmek için, hızlı, basit, son derece spesifik olabilir ve maliyet etkin şekilde tasarlanmıştır. Bunu başarmak için, tahlilin geliştirilmesi her aşaması, analiz tek tek proteinler ve dokular için optimize edilmelidir. Bu yöntem, çeviri için hedeflenen bir proteomik MRM LC-MS / MS geliştirmek için çeşitli ipuçları ve da dahil olmak üzere, tipik bir iş akışı tarif .
yöntem geliştirme tespiti için MS kalibre triptik quantotypic peptidler, özel olarak sentezlenmiş sürümleri kullanılarak optimize edilmiş ve daha sonra önceki MS analizi kromatografik ayırma endojen peptid doğru tanımlanmasını belirlemek için BOS içine çivili. Absolu elde etmek içinte niceleme, kısa amino asit sekansı etiketler ve tripsin klivaj sahası içeren peptidlerin izotop etiketli dahili standart sürümleri, deneyde yer almaktadır.
Introduction
Alzheimer hastalığı, Lewy Body Demansı ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların artan etkisi pek çok ülkede 1 bir sosyoekonomik konusu haline gelmektedir. belirlemek ve hastalığın erken aşamalarında hastaları sınıflandırmak ve herhangi bir potansiyel yeni tedavi izlemek için kullanılabilecek ek biyolojik bir ihtiyaç vardır. Bu yöntemin genel amacı, nörodejenerasyon potansiyel BOS belirteçleri doğrulamak bir aerodinamik ekonomik ve daha hızlı bir şekilde için genel bir boru hattı oluşturmaktır. gerekçesi bulma deneyler birden fazla potansiyel protein biyolojik değerlendirmek için kolay amendable yöntem olarak hedeflenen proteomik veya peptit MRM LC-MS / MS kullanmaktır. Bunlar daha hızlı bir kromatografik ayırma (<10 dakika) ve değerlendirilen üzerinde multiplekslenebilmektedir. nörodejeneratif biyomarkerların için bu multipleks ekran içinde, biz bilinen demans risk faktörü apolipoprotein izoformunu E4 (APOE4) dahil ettik bu yüzden can bu ayrı genotipleme testleri 2 ihtiyacını ortadan kaldırarak aynı anda durumunu ve ifade seviyesini belirlemek. LC MS / MS rutin doğru örneğin ELISA veya radyoimünoanaliz (RIA) gibi diğer yöntemlere göre küçük molekülleri ölçülmesi için tercih edilen bir yöntem olarak kullanılmaktadır. analiz proteinlere MS teknolojisinin kullanımı bu değişim, bağışıklık tabanlı teknolojiler ile ilgili sorunlar ağırlıklı olarak tahrik edilmiştir. Bu çapraz-özgüllük, toplu toplu varyasyonuna, sınırlı raf ömrü ve yüksek maliyeti dahil. Bu nedenle, hedeflenen proteomik hızla böyle Western blot, RIA ve ELISA antikor bazlı yöntemlere büyüyen bir alternatif haline geliyor. Bununla birlikte, tek bir tahlil çok işaret multipleks yeteneği bağışıklık esaslı yöntemler üzerinde 3 bu tekniğin önemli bir avantajdır. Tekniğin birçok dokuda uygulanabilir ve plazma 4 idrar 5,6 dahil olmak üzere birçok proteomik çalışmalar için bir onaylama stratejisi olarak kullanılmıştır.
technique üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanarak erişim ve uzmanlığa sahip bir laboratuvara uygulanabilir. Peptit tasarımı açık kaynak veritabanlarının artan kullanımı ile oldukça basittir. özel peptidler sentez rekabetçi piyasa onlara çok daha uygun hale getirir. Ağır peptidler, Bununla birlikte, pahalı olan ve bu nedenle belirteçler daha büyük bir ölçekte geçmeden önce küçük bir grup ile değerlendirilmelidir. teknik en büyük hastaneler kolayca hedeflenen proteomik deneyleri çalıştırmak için adapte edilebilir üçlü dört tabanlı platformlar sahip, klinik tanı ortamlarda kullanılmak üzere artan potansiyeli bulunmaktadır. Yöntemin Böyle bir uygulama, rutin tanı ayar içine yapım, orak hücreli anemi 7 yenidoğan kan nokta tarama son zamanlarda bir uygulamadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm MS bazlı deneyler gibi, yöntemde kritik adım iç standart uygun ve doğru miktarlarda tespitidir. Mutlak niceleme kullanılıyorsa, o zaman, standart eğri çivili peptidlerin, doğru miktarlarda kritiktir.
Bizim tahlil CSF veya öncesinde MS analizi temiz yukarı veya tuzsuzlaştırma adımlardan her türlü kullanım yağış gerektirmez – bu tamamen tek kap reaksiyonu yöntemidir. Nedeniyle CSF küçük hacimli ve sınırlı karmaşıklığı (plazmaya kıyasla) için, bu adımlar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
Referências
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. . Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer’s disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
