זיהום הניסיון עם<em> חיידקי ליסטריה</em> כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ
Summary
This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-γ (IFN-γ) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.
Abstract
ל חיידקים הוא חיידק גראם חיובי כי הוא הגורם למחלה שמקורן במזון בבני אדם. זיהום ניסיוני של עכברים עם הפתוגן זה כבר אינפורמטיבי מאוד על עצם את התפקיד של תאי מערכת חיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות וציטוקינים ספציפי חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים. הייצור-γ IFN ידי תאי מולד במהלך הדבקת sublethal עם חיידקי L. חשוב להפעלת מקרופאגים ובקר מוקדמים של הפתוגן 1-3. בנוסף, ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים זיכרון אדפטיבית חשוב תחול ההפעלה של תאי מולד על הדבקה חוזר 4. ל חיידקי מודל זיהום ובכך משמש כלי נהדר עבור חוקרת האם טיפולים חדשים אשר נועדו להגביר את ייצור IFN-γ להשפיע על תגובות IFN-γ in vivo ויש להם תופעות ביולוגיות פרודוקטיבי כגון הגדלת אישור חיידקים או שיפור הישרדות עכבר מהַדבָּקָה. המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי איך לנהל זיהומים intraperitoneal של C57BL / 6J עם זן EGD של חיידקי L. וכדי למדוד ייצור IFN-γ על ידי תאי NK, תאי NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית ידי cytometry הזרימה. בנוסף, הליכים מתוארים ל: (1) לגדול ולהכין את החיידקים עבור חיסון, (2) למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד, ו (3) הישרדות בעלי חי מידה לנקודות קצה. נציג נתונים ניתנים גם כדי להמחיש כיצד מודל זיהום זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים ספציפיים על התגובות IFN-γ כדי חיידקי L. והישרדות של עכברים מזיהום זה.
Introduction
IFN-γ הוא ציטוקין כי הוא חיוני בתיווך חסינות מפני פתוגנים תאיים לבקרת צמיחת גידול 5. חשיבותה של ציטוקינים זה עמיד החיידקים באה לידי ביטוי העובדה שבני האדם עם מוטציות מסלול איתות IFN-γ הן רגישות מאוד לזיהום עם mycobacteria ו salmonellae 6. בדומה לכך, עכברים שחסרים לו או IFN-γ או פגמי IFN-γ קולטן התערוכה העמיד mycobacteria 7-9 ופתוגנים תאיים אחרים לרבות ל חיידקי 10,11, שושנת יריחו מרכזי 12, סלמונלה typhimurium 13, וכן וירוסים מסוימים 11. בנוסף פתוגנים ללחום, IFN-γ ממלא תפקיד מכריע מארח הגנה מפני גידולים 14. למרות ייצור גבוה יותר של-γ IFN מועיל בהקשר של זיהום או סרטן, ייצור ממושך של ציטוקינים זה נקשר to להתפתחות אוטואימיוניות מערכתית 15-17 והאצת סוכרת מהסוג במודל העכבר הסוכר ללא השמנת היתר 18.
המקורות העיקריים של-γ IFN כוללים תאי NK, תאי NKT, γδ בתאי T, 1 T מסייעים (Th1) תאים, לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL) 5,19,20. IFN-γ משפר הוא חסינות מולד אדפטיבית ידי: (1) עד ויסות histocompatibility הגדולה מורכב (MHC) אני בכיתה ו- II ביטוי, (2) להגדיל את הביטוי של מולקולות שיתוף גירוי על תאי מציגי אנטיגן, (3) מקרופאג שיפור phagocytosis ואת הייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים הגורמים microbicidal (למשל, תחמוצת החנקן מינים חמצן תגובתי), (4) לקדם את התמיינות של תאים מסוג CD4 + T נאיבי לתוך תאים מפעיל Th1, (5) קידום מיתוג בכיתה נוגדנים אימונוגלובולינים ( איג) 2a ו IgG3 (עכבר), (6) גרימת לייצור כמוקינים לגייס תאים חיסוניים לאתרים של infection, ו (7) שיפור תא NK ותגובות CTL 5,19. לאור החשיבות החיונית של γ IFN בתגובת מארח לפתוגנים וגידולים, IFN-γ רקומביננטי נבדק כטיפול זיהומים ומחלות ממאירות שונות (הנסקרת ב 19). עם זאת, כי ממשל מערכתי של IFN-γ או ציטוקינים קידום Th1 interleukin-12 (IL-12) קשור תופעות לוואי ומנה הקשורות רעיל 19,21, יש עניין בפיתוח אסטרטגיות חלופיות כדי להגביר את ייצור IFN-γ על ידי תאי מערכת החיסון. פיתוח התרופות ביולוגי חדשות ומולקולות קטנות דורש כלי הקרנת vivo כדי לבדוק אם סוכנים כאלה להגדיל את ייצור IFN-γ במהלך תגובה חיסונית והאם זה מיתרגם השפעות ביולוגיות משמעותיות, כגון העלאות הישרדות בעלי חיים.
זיהום ניסיוני של עכברים עם חיידקי L. חיידק גראם חיובי כבר מודל אינסטרומנטליפענוח את התפקיד של γ IFN ב-חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים 1,22. זיהום של עכברים עם הפתוגן לוריד או intraperitoneally (IP) מוביל בהפצה המהירה של החיידקים אל הטחול והכבד, שם הם הופכים הפנימו ידי מאקרופאגים hepatocytes תושב עם המון חיידקי שיא בטחול המתרחשים בין 3 ל -4 ימים שלאחר זיהום 1,3,22. ייצור-γ IFN ידי תאי NK חשוב ההפעלה מקרופאג והתנגדות מוקדם כנגד הפתוגן 3; עם זאת במינונים גבוהים זיהומיות, הפקה-γ IFN יכולה גם להזיק אישור הפתוגן 23. תאים NKT הם גם מקור-γ IFN בטחול ובכבד במהלך מלאה מוקדם של פתוגנים 2,24 וייצור זו הוכח להגביר ייצור IFN-γ על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי NK 2. מצד שני, לאחר מכן הפועל לימפוציטים מסוג T אדפטיבית, תאי CD8 + T ב Particular, חשוב לתיווך סליקת הפתוגן ומתן הגנה מפני 1,4,22 זיהום מחדש.
מודל זיהום זה כבר אטרקטיבי החוקר במשך מספר סיבות (הנסקרת ב 1). ראשית, זיהום עם הפתוגן הוא מאוד לשחזור ומשרת תגובה חיסונית חזקה Th1 וסלולר. שנית, במהלך ההדבקה sublethal, עומס חיידקי מרוכזת הכבד והטחול בו ניתן למדוד בקלות. שלישית, הפתוגן ניתן לטפל בבטחה תחת 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) תנאים. רביעית, האורגניזם ואת התגובה החיסונית כי היא יוצרת, מתאפיינת בהרחבה. לבסוף, מגוון של זנים מוטנטים ו-מהונדסים גנטית פותחו זמינים לשימוש.
המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי עבור חיסון של C57BL / 6J עם זן EGD של ל חיידקי 25 ו למדידת IFN – γ מחדשsponses ידי NK, NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית שלאחר זיהום. כמו כן הוא תאר כיצד למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד לאחר הדבקת sublethal ולבצע מחקרי הישרדות לאחר הדבקה עם מנת LD 50 שונה של הפתוגן. לבסוף, נציגי נתונים מוצגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקרין את ההשפעה של טיפולים חדשים על תגובות IFN-γ והישרדות עכבר ל חיידקי זיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a protocol of how to carry out a basic experimental infection with the EGD strain of L. monocytogenes25 in male or female C57BL/6J mice. This protocol was set up for the purpose of studying the effect of a novel small molecule IS001 on IFN-γ production by innate and adaptive lymphocytes in vivo31. By monitoring bacterial clearance and survival post-infection, insights were gained into how these changes in IFN-γ impacted the host's ability to control t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
Referências
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
