Определение субстрата специфичностью для липазы и фосфолипазы кандидатов
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
Микроорганизмы производят широкий спектр (фосфо) липаз, которые секретируются для того, чтобы внешние субстраты для организма. В качестве альтернативы, другие (фосфо-) липазы могут быть физически связаны с продуцирующего организма в результате чего оборот собственных липидов и часто порождая ремоделирование клеточных мембран. Хотя потенциал (фосфо-) липазы может быть предсказано с рядом алгоритмов, когда последовательность гена / белок доступен, экспериментальное доказательство активности ферментов, субстрат специфичностью, а также потенциальных физиологических функций часто не было получено. Эта рукопись описывает оптимизацию условий анализа для потенциальных (фосфо) липазы с неизвестными подложки и специфичностью, как использовать эти оптимизированные условия в поисках природного субстрата соответствующего (фосфо) липазы. Использование искусственных хромогенных субстратов, таких как производные р – нитрофенил, может помочь обнаружить незначительныеферментативная активность для предсказанного (фосфо) липазы в стандартных условиях. Столкнувшись такую незначительную ферментативную активность, особые параметры твердофазного иммуноферментного анализа фермента можно варьировать, чтобы получить более эффективный гидролиз искусственном субстрате. После определения условий, при которых фермент работает хорошо, разнообразие возможных природных субстратов должны быть исследованы на их деградации, процесс, который может сопровождаться использованием различных хроматографических методов. Определение субстратной специфичности в отношении новых ферментов, часто дает гипотезы для потенциальной физиологической роли этих ферментов, которые затем могут быть проверены экспериментально. Следуя этим рекомендациям, мы смогли идентифицировать фосфолипазу С (SMc00171) , который унижает фосфатидилхолин к фосфохолин и диацилглицерол, на решающем этапе для ремоделирования мембран в бактерии Sinorhizobium meliloti при фосфорных ограничивающими условиях роста. Для двух предсказывал patatin-как фосфолипаз (SMc00930 и SMc01003) одного и того же организма, мы могли бы пересмотреть свои субстратную специфичность и уточнить, что SMc01003 является диацилглицеринацилтрансферазы липазы.
Introduction
Глицерин на основе липидов , такие как триацилглицеринов и (глицеро) фосфолипиды являются важными и , вероятно , наиболее известные классы липидные 1. Триацилглицерины (БИРКАХ) являются жиры или масла, которые обычно функционируют как липиды хранения, и, следовательно, в качестве потенциальных энергетических и углеродных источников. ДВТ может быть понижена липазы, которые часто выделяемыми продуцирующего организма переваривать внешних бирками и сделать их доступными в качестве источников углерода. Кроме того , липазы широко изучались на протяжении многих лет из – за их важных биотехнологического применения 2.
Из – за их амфифильного характера и их почти цилиндрическое форме (глицеро) фосфолипиды экспоната мембранообразующих свойств и , как правило , представляют собой основные липидные компоненты двухслойных мембраны 3. В простых микроорганизмов, таких как бактерии кишечной палочки, только три основных варианта головной группы, фосфатидилглицерина (PG), кардиолипину (CL), и phosphatidylethanolamine (PE) встречаются, хотя следует иметь в виду , что каждый из них может быть заменен с большим количеством различных жирных ацильных цепей в зп -1 или -2 зп ситуация , вызвавшая большое количество различных видов молекул ; 4 , Другие бактерии могут иметь другие фосфолипиды в дополнение или вместо. Например, Sinorhizobium meliloti, бактерия почвы, которая способна образовывать азотфиксирующую клубеньковых симбиозе с бобовой люцерны (Medicago сатива), содержит в дополнение к РЕ а второй цвиттерионная фосфолипид, фосфатидилхолин (PC) 5. Кроме того, липиды, не содержащие фосфор или глицерин могут быть амфифильными и являются составной частью клеточной мембраны. Например, при условиях роста фосфором ограничения, в S. meliloti, (глицеро) фосфолипиды в значительной степени заменены мембранными липидами , которые не содержат фосфор, то есть, сульфолипидов, орнитин липиды, и diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. У бактерий DGTS образуется из диацилглицерина (DAG) в двухступенчатом пути 7 , но источник для генерации DAG не было понятно. Пульс-чейз эксперименты показали, что ПК может быть предшественником для DGTS 8 и с использованием методики , описанной в этой рукописи мы могли идентифицировать фосфолипазу С (PLCP, SMc00171) , который формируется под фосфорных ограничивающими условиями и который может преобразовать ПК в DAG и фосфохолина 8.
В отдельном исследовании, мы обнаружили , что ацил-КоА – синтетазы (Fadd) дефицитных мутант S. meliloti или кишечной палочки накопила свободных жирных кислот при входе в стационарной фазе роста 9. Хотя эти жирные кислоты, казалось, быть получены из мембранных липидов, точный источник свободных жирных кислот или фермента (ов), что их высвобождают не были известны. Опять же , применяя стратегию , изложенную в этой рукописи, два пататина типа 10 (фосфо-) липазы (SMc00930 и SMc01003) , что способствовало образованию свободных жирных кислот в S. meliloti 11 были предсказаны. Удивительно, но SMc01003 использовали DAG в качестве субстрата , преобразовав его в monoacylglycerol и , наконец , глицерин и свободные жирные кислоты 11. Поэтому SMc01003 является липаза DAG (DGLA).
Хотя ряд алгоритмов существуют для прогнозирования потенциального (фосфо) липазы 12,13, их точная функция и физиологическая роль, как правило , не известно. Здесь мы приводим протокол, клонировать и гиперэкспрессией предсказанных или потенциальных (фосфо) липазы. Эта рукопись объясняет, как анализы ферментов могут быть разработаны и оптимизированы для суперэкспрессированный (фосфо) липазы с использованием искусственных хромогенных субстратов. Мы приводим примеры, как с оптимизированной ферментного анализа реальной (фосфо) липаза субстрат можно встретить и каким образом эти результаты могут обогатить наше понимание микробной физиологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последние 20 лет, геномы многих организмов были секвенированы и хотя множество данных последовательностей генома была сформирована, функциональная интерпретация отстает и, следовательно, затрудняет наше понимание функции генома. функции генов в геномах часто присваиваются на осно…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Consejo Nacional де Ciencias у Tecnología-México (КОНАСИТ-Мексика) (82614, 153998, 253549 и 178359 в Investigación Cientifica BASICA, а также 118 в Investigación ан Fronteras-де-ла-Ciencia) и от Dirección генерала де Asuntos де Личный Academico-Autónoma Universidad Nacional де Мехико (DGAPA-НАУ; PAPIIT IN202616, IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
Referências
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
