Muitas (fosfo)lipases previstas são mal caracterizadas em relação às suas especificidades de substrato e funções fisiológicas. Aqui fornecemos um protocolo para otimizar as atividades enzimáticas, procurar substratos naturais e propor funções fisiológicas para essas enzimas.
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Artigo de método
Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microorganismos produzem um largo espectro de lipases (fosfo) que são secretadas, a fim de fazer substratos externos disponível para o organismo. Alternativamente, outros (fosfo) lipase pode ser fisicamente associado com o organismo produtor causando uma rotação de lípidos intrínsecas e frequentemente dando origem a uma remodelação das membranas celulares. Embora potenciais (fosfo) lipase pode ser previsto com um certo número de algoritmos quando a sequência do gene / proteína está disponível, não tem frequentemente sido obtida prova experimental das actividades enzimáticas, especificidades de substrato, e funções fisiológicas potenciais. Este manuscrito descreve a optimização das condições de ensaio para a (fosfo) lipase prospectivos com especificidades de substrato desconhecidos e como empregar estas condições optimizadas na pesquisa para o substrato natural de um respectivo (fosfo) lipase. Usando substratos cromogénicos artificiais, tais como derivados de p-nitrofenilo, pode ajudar a detectar uma menoractividade enzimática para um (fosfo) lipase previsto, sob condições padrão. Tendo encontrado uma actividade enzimática, tais menor, os parâmetros distintos de um ensaio de enzima podem ser variados de modo a obter uma hidrólise mais eficiente do substrato artificial. Depois de ter determinado as condições sob as quais uma enzima funciona bem, uma variedade de substratos naturais potenciais devem ser ensaiadas quanto à sua degradação, um processo que pode ser seguido utilizando métodos cromatográficos diferentes. A definição das especificidades de substrato para enzimas novas, frequentemente fornece hipóteses para um potencial papel fisiológico destas enzimas, que podem então ser testados experimentalmente. Seguindo essas orientações, fomos capazes de identificar uma fosfolipase C (SMc00171) que degrada fosfatidilcolina para fosfocolina e diacilglicerol, em um passo crucial para a remodelação das membranas na bactéria Sinorhizobium meliloti das condições de limitação de fósforo de crescimento. Para duas previu patatin-como fosfolipases (SMc00930 e SMc01003) do mesmo organismo, que poderia redefinir suas especificidades de substrato e esclarecer que SMc01003 é uma lipase diacilglicerol.
Introdução
Lípidos à base de glicerol como triglicerídeos e fosfolipídios (glicero) constituem importante e, provavelmente, as classes de lípidos mais conhecidos 1. Triacilgliceróis (tags) são as gorduras e óleos, que normalmente funcionam como lipídios de armazenamento e, portanto, como potenciais fontes de energia e de carbono. As tags podem ser degradados por lipases, que são frequentemente segregadas pelo organismo produtor de digerir TAGs externas e torná-los disponíveis como fontes de carbono. Além disso, lipases têm sido amplamente estudados ao longo dos anos devido às suas importantes aplicações biotecnológicas 2.
Devid....
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Protocolo
1. O clone e gene estrutural para sobre-expressar a lipase Previsto
- Usando reacção em cadeia da polimerase (PCR) 14 e oligonucleótidos específicos (Tabela 1) 15, amplificar o gene de interesse (smc01003, smc00930, ou smc00171), previsto para codificar para uma lipase ou fosfolipase, a partir do ADN genómico do organismo hospedeiro (ou seja , S. meliloti).
- Introduzir locais específicos de restrição (com a sequência dos oligonucleótidos concebidos). Digerir o fragmento de DNA amplificado com as enzimas de restrição correspondentes e cloná-lo num vector de expressão, ....
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Resultados
Actividade de Fosfolipase específico para PC C SMc00171 com bis-p-nitrofenil fosfato
Extractos isentos de células obtidos a partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, que tinha smc00171 expressa, foram estudados quanto à sua capacidade para hidrolisar ésteres de fosfato de bis-p-nitrofenilo, utilizando um ensaio espectrofotométri.......
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Discussão
Nos últimos 20 anos, os genomas de muitos organismos já foram seqüenciados e, apesar de uma riqueza de dados seqüência do genoma foi gerado, interpretação funcional está ficando para trás e, portanto, dificulta a nossa compreensão da função do genoma. funções dos genes em genomas são frequentemente atribuídos com base na similaridade com genes de função ou a ocorrência de motivos conservados conhecido. No entanto, a função exacta de um determinado gene, muitas vezes não é conhecido. Especialmente, previu genes estrutura.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações do Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-México) (82614, 153998, 253549 e 178359 em Investigación Científica Básica, bem como 118 em Investigación en Fronteras de la Ciencia) e da Dirección General de Asuntos de pessoal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Clorofórmio | JT Baker | 9180-03 | Análise e análise TLC Extração lipídica |
| Metanol | JT Baker | 9070-03 | Análise de TLC & Extração de lipídios |
| Ácido acético | JT Baker | 9507-05 | Análise de TLC e Extração de lipídios |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | Análise de TLC e Extração lipídica |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Ensaios enzimáticos |
| água bidestilada | QUALQUER& | nbsp; NA | Ensaios enzimáticos |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Ensaios enzimáticos |
| HCl | Baker | 9535-02 | Ensaios enzimáticos |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Ensaios enzimáticos |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Ensaios enzimáticos |
| LB caldo | QUALQUER | NA | Crescimento bacteriano, 10 g de triptona + 5 g de extrato de levedura + 10 g de NaCl por litro de triptona de água bidestilada |
| Becton Dickinson and Company | 211705 | de crescimento bacteriano | |
| Becton Dickinson and Company | 212750 | Crescimento bacteriano | |
| Caldo TY ANY | NA | Crescimento bacteriano, 8 g de triptona + 3 g de extrato de levedura + 66 mg CaCl2· 2H2O por litro de água bidestilada | |
| CaCl2· 2H2O | Baker | 1332-01 | Ensaios enzimáticos |
| isopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Crescimento bacteriano |
| Dietanolamina | Sigma | D-8885 | Ensaios enzimáticos |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Ensaios enzimáticos |
| Fosfolipase A2 cobra veneno | Sigma | P0790 | Ensaios enzimáticos |
| Fosfolipase C Clostridium perfringens | Sigma | P7633 | Ensaios enzimáticos |
| Bis-p-fosfato de nitrofenil | Sigma | 07422AH | Ensaios enzimáticos |
| p-nitrofenil estearato | Sigma | N3627 | Ensaios enzimáticos |
| p-nitrofenilo | Sigma | 61716 | Ensaios enzimáticos |
| p-decanoato de nitrofenilo | Sigma | N0252 | Ensaios enzimáticos |
| p-nitrofenil palmitato | Sigma | N2752 | Ensaios enzimáticos |
| p-butirato de nitrofenilo | Sigma | N9876 | Ensaios enzimáticos |
| p-nitrofenil octanoato | Sigma | 21742 | Ensaios enzimáticos |
| Ácido acético, sal de sódio [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | crescimento bacteriano |
| (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Ensaios enzimáticos |
| Gel de sílica HPTLC de alumínio 60 placas. Placas de HPTLC de sílica gel tamanho 20 x 20 cm, 25 folhas. | Análise e | 105547 | Espectrômetro de extração de lipídios |
| UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Ensaios enzimáticos |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Scanner de luminescência fotoestimulável |
| Contador de Cintilação Multifuncional | Beckman Coulter | NA | Quantificação de Radioatividade |
| Célula de Pressão Francesa | ThermoSpectronic | NA | Quebra de células |
| papel de cromatografia 3MM Chr | Whatman | 3030917 | análise TLC |
| Sinorhizobium meliloti 1021nossa | referência 11 | cepa estudada | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Células competentes | Novagen | 69451 | cepa de expressão de proteína |
| pET9a vetor Novagen | 69431 | vetor de expressão de proteína | |
| vetor pET17b | Novagen | 69663 | vetor de expressão de proteína |
| tubo de fundo redondo de poliestireno estéril (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiomarcação de culturas bacterianas |
| tubos de microcentrífuga de polipropileno (1,5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Ensaios enzimáticos |
| 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol | Sigma | D9135 | padrão lipídico |
| L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoíla | Sigma | P6267 | padrão lipídico |
| DL-&alfa;-monopalmitina Sigma | M1640 | padrão lipídico | |
| ácido palmítico | Sigma | P0500 | padrão lipídico |
Referências
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes.
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Reimpressões e permissões
