L'Assemblée et l'application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Déviations de niveaux et les modes de jeu de cisaillement des rôles importants dans la physiologie des fluides vasculaires vasculaires et physiopathologie normales en induisant adaptative ainsi que des changements pathologiques dans le phénotype endothélial et l'expression génique. En particulier, les effets dysfonctionnels de périodiques, flux unidirectionnel contrainte de cisaillement induite peuvent déclencher une variété d'effets sur plusieurs types de cellules vasculaires, en particulier les cellules endothéliales. Alors que maintenant les cellules endothéliales d'origines anatomiques diverses ont été cultivées, des analyses approfondies de leurs réponses au cisaillement de fluide ont été entravés par la complexité relative des modèles de cisaillement (par exemple, la chambre d'écoulement à plaques parallèles, le cône et le modèle d'écoulement de la plaque). Bien que ces approches représentent tous excellents, ces modèles sont techniquement complexes et des inconvénients, y compris relativement long et complexe le temps d'installation, les zones de surface faible, les exigences pour les pompes et pressurisation nécessitant souvent des produits d'étanchéité et des joints, ce qui crée des défis à both maintien de la stérilité et une incapacité à exécuter plusieurs expériences. Toutefois, si les modèles de débit plus élevés de flux et de cisaillement étaient disponibles, plus de progrès sur les réponses de cisaillement endothéliales vasculaires, la recherche de cisaillement particulièrement périodique au niveau moléculaire, peut-être plus rapidement avancé. Ici, nous décrivons la construction et l'utilisation des anneaux de cisaillement: un roman, simple à assembler, et peu coûteux modèle de culture de tissu avec une relativement grande surface qui permet facilement d'un nombre élevé de répétitions expérimentales unidirectionnels, cisaillement périodique des études de stress sur cellules endotheliales.
Introduction
La contrainte de cisaillement du fluide a été montré pour moduler les programmes de gènes endothéliaux : 1 – 5 par l' activation des éléments cis-régulateurs 6, l' activité histone acétyltransférase 7 et des éléments de réponse de contrainte de cisaillement (8 SSRE). Cisailler les influences des contraintes apports endotheliales vers la coagulation par la modulation du facteur tissulaire 9 et de l' activateur tissulaire du plasminogène (tPA) 10 l' expression. La contrainte de cisaillement influe également sur le contrôle de l' angiogenèse 11 et le remodelage vasculaire en régulant la synthèse PDGF-B et la réactivité 8. Le endothéliales dérivé des médiateurs vasoactifs adrénomédulline, endothéline-1, urotensine II et relaxine sont également réglementés par cisaillement 12. La transcription de la production d' oxyde nitrique synthase endothéliale et la production d'oxyde nitrique sont tous les deux dépendants 10 de cisaillement. Shear contrôle également endothéliale ICAM-1 expression 13. contrainte de cisaillement induite par Flow-peut donc powerfuinfluencer lly une grande variété de réponses endothéliales. Surtout, les pulsations vasculaires maintenant semblent également jouer un rôle important dans la physiopathologie de la fois le vieillissement vasculaire normal et les formes de démence vasculaire 14 et peuvent même contribuer à d' autres maladies neurodégénératives telles que la sclérose en plaques 15.
Veineuses et artérielles cellules endothéliales sont intrinsèquement exposés à divers modes d'écoulement hémodynamiques in vivo, et de nombreux différents phénotypes de cellules endotheliales peuvent être exposés 16. Selon l'ampleur et la périodicité des flux, les effets sur les cellules endothéliales peuvent inclure l' activation des cellules inflammatoires et l' apoptose, ce qui peut refléter les changements dans le gène ou l' expression des protéines 17,18. Les études sur les réponses des cellules endothéliales au cisaillement phénomènes restent donc compliquée par les difficultés dans la production des modèles in vitro qui produisent de manière adéquate ces modèles de cisaillement.
Beaucoup experime différentsprotocoles NTAL ont été développés pour appliquer une contrainte de cisaillement de fluide endothéliales monocouches de cellules. L' un des systèmes les plus couramment utilisés est la chambre d'écoulement à plaques parallèles, ce qui crée un écoulement laminaire uniforme au sein de la chambre 19 – 21. Une pompe péristaltique est généralement connecté pour créer un flux périodique, qui peut récapituler les caractéristiques d'écoulement généralement trouvés dans de nombreux endroits in vivo 22. Un autre set-up commun utilise le modèle de cône et de la plaque », où la contrainte de cisaillement du fluide est déterminée par la vitesse du cône 23 de rotation. Les deux systèmes, et d'autres arrangements semblables à elles, peuvent être fastidieux à mettre en place et nécessitent des composants qui peuvent être relativement coûteux et inaccessibles à de nombreux laboratoires.
Une autre limitation majeure de ces modèles actuels est le nombre relativement faible d'études répétées qui peuvent être exécutées simultanément, chacun avec une surface relativement faible. Cela augmente le temps et le co mplexity de telles approches. Par conséquent, un modèle idéal qui induit un cisaillement unidirectionnel et périodique pourrait être celui où un grand nombre de répétitions de l'étude peut être facilement mis en place, chacun avec une relativement grande surface. En outre, les modèles mentionnés ci-dessus nécessitent une configuration assez sophistiqué, qui peut être un coût prohibitif pour de nombreux utilisateurs. Un modèle qui peut produire des perturbations de cisaillement de fluide en utilisant des matériaux de laboratoire de base pourrait avoir plusieurs avantages.
Une méthode simple et très économique d'application unidirectionnelle contrainte de cisaillement, périodique implique le placement de plats circulaires sur un agitateur orbital 24. Ce protocole est très simple et peut être étendu pour atteindre le nombre élevé d'études se réplique, chacun avec une relativement grande surface, au besoin. Cependant, les cellules situées dans le centre du plat sont exposés à différents modèles de flux de cellules le long de la périphérie, ce qui donne des réponses phénotypiques cellulaires mixtes dans le même plat.
_content "> Dans ce rapport, nous décrivons la construction et l'utilisation des« anneaux de cisaillement », notre modèle pour la création d'une contrainte de cisaillement unidirectionnel et périodique. La conception de l'anneau de cisaillement efficacement phénotypes induits par cisaillement cellulaires« mixtes »limites en limitant le flux voie dans une boîte de culture circulaire à la périphérie par le placement d'une bague intérieure. la construction et l'exploitation de l'anneau de cisaillement est simple et économique et peut être facilement mis à l'échelle pour accueillir une large gamme de secoueurs orbitaux en utilisant largement disponibles fournitures de culture de tissus. Cette modèle peut être appliqué dans des expériences de cellules endothéliales pour fournir des modèles d'écoulement continues et périodiques à des niveaux physiologiques et physiopathologiques.Protocol
Representative Results
Discussion
La construction du système d'anneau de cisaillement pour exposer les cellules endothéliales au cisaillement est une approche simple pour effectuer des études de contrainte de cisaillement. Néanmoins, il y a quelques étapes qui sont essentielles pour l'obtention d'anneaux de cisaillement supérieurs et de meilleurs résultats. Un joint d'étanchéité complète doit être faite entre la bague intérieure et extérieure pour empêcher les médias de fuite qui pourrait créer une contrainte de cisaille…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l'aide de M. Christopher Nguyen, Aaron Hunter et Shreveport Jumpstart, SMART, et les programmes de formation biostart ainsi que le département de biophysique, Shreveport, LA Centenary College of Louisiana.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
Referências
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