「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
適応だけでなく、内皮表現型と遺伝子発現の病理学的変化を誘導することにより、血管生理学および病態生理学における血管の流体せん断重要な役割を果たしての正常レベルとパターンからの逸脱。具体的には、定期的に、一方向の流動誘起剪断応力の不適応な効果は、いくつかの血管の細胞型、特に内皮細胞上のさまざまな効果を引き起こすことができます。今では、多様な解剖学的起源から内皮細胞が培養されているが、中・深さは、流体のせん断に対する反応の解析せん断モデル（ 例えば、平行平板フローチャンバー、コーン・プレート・フロー・モデル）の相対的な複雑さによって妨げられてきました。これらのすべては優れたアプローチを示しているが、このようなモデルは、ボットへの挑戦を作成し、技術的に複雑であり、比較的長く、複雑なセットアップ時間、低表面積、多くの場合、シーラントおよびガスケットを必要とするポンプと加圧用の要件などの欠点があります時間無菌性の維持及び複数の実験を実行することができません。しかし、流れ及びせん断のより高いスループットモデルが利用可能であった場合は、血管内皮せん断応答、分子レベルで、特に定期的なせん断研究に大きな進展、より急速に進んだことがあります。簡単に単方向、周期的なせん断応力試験で実験的な反復の数が多いを可能にする比較的大きな表面積を持つ、簡単に組み立て小説、かつ安価な組織培養モデル：ここでは、せん断リングの構造や使用方法を説明します内皮細胞。
Introduction
シス調節エレメント6の活性化、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性7と剪断応力応答エレメント（SSRE）8を介して5 –流体せん断応力は、内皮遺伝子プログラム1を調節することが示されています。組織因子9及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）10発現を調節することによって、応力の影響を凝固向かっ内皮寄与せん断。せん断応力もPDGF-Bの合成と応答8を制御することにより、血管新生11と血管リモデリングの制御に影響を与えます。内皮由来の血管作動性メディエーターのアドレノメデュリン、エンドセリン-1、ウロテンシンIIおよびリラキシンはまた、せん断12によって規制されています。内皮型一酸化窒素合成酵素の産生および一酸化窒素産生の転写は、両方のせん断依存10です。せん断はまた、内皮ICAM-1の発現13を制御します。したがってpowerfuでき流れによって誘発されるせん断応力LLY内皮応答の多種多様な影響を与えます。重要なことには、血管の脈動は、現在、正常な血管の老化および血管性認知症14の形態の両方の病態生理に重要な役割を果たしているように見え、さらに、多発性硬化症15のような他の神経変性疾患に寄与し得ます。
静脈および動脈の内皮細胞は、本質的に、生体内で多様な血行力学的流動パターンに曝される、多くの異なる内皮細胞表現型は、16を発揮することができます。流れの大きさと周期性に依存して、内皮細胞への影響は、遺伝子またはタンパク質発現17,18の変化を反映することができる、炎症性細胞の活性化およびアポトーシスを含むことができます。現象を剪断する内皮細胞応答の研究は、したがって、十分にそのような剪断パターンを生成するインビトロモデルにおける生産の難しさによって複雑に残ります。
多くの異なるexperimeNTALプロトコルは、細胞単層の内皮細胞に流体せん断応力を適用するために開発されています。 21 –最も一般的に使用されるシステムの一つは、チャンバ19内に均一な層流を生成する平行プレートフローチャンバーです。蠕動ポンプは、典型的には、典型的には、インビボ 22 内の多くの場所に流れ特性を再現することができる周期的な流れを作成するために接続されています。他の一般的なセットアップは、流体せん断応力は、コーン23の回転速度によって決定されます。「コーン・プレート」モデルを使用しています。どちらのシステムも、それらに類似する他の構成は、セットアップし、多くの研究室には比較的高価で、アクセスできなくすることができるコンポーネントを必要とする退屈することができます。
これらの現在のモデルのもう一つの主要な制限は、同時に、比較的低い表面積を有する、それぞれ行うことができる反復試験の比較的少数です。これは、時間と共増加しますこのようなアプローチのmplexity。したがって、単方向および定期的なせん断を誘導する理想的なモデルは、比較的大きな表面積を持つ研究の複製の数が多いが簡単に設定することができます1、それぞれのかもしれません。また、上記のモデルは、多くのユーザーのためにコスト高であってもよい、かなり洗練されたセットアップが必要です。基本的な実験用材料を用いた流体せん断障害を生成することができますモデルは、いくつかの利点があるかもしれません。
単方向、定期的なせん断応力を印加したシンプルかつ非常に経済的な方法は、オービタルシェーカー24上に円形の皿を配置することを含みます。必要に応じて、このプロトコルは、非常に単純であり、研究の反復の高い数字を達成するためにスケールアップすることができ、比較的大きな表面積を持つ各。しかし、皿の中央に位置するセルは、同じ皿の中の混合の細胞表現型の応答を得、周囲に沿って細胞とは異なる流れのパターンにさらされています。
_content ">この現在のレポートでは、「せん断リング」、単方向および定期的なせん断応力を作成するための我々のモデルの構築および使用について説明します。デザインをせん断リングのために効果的に制限「混合」携帯せん断誘発性表現型をフローを制限することにより、内輪の配置を介して周囲に円形の培養皿内経路せん断リングの構成及び動作は簡単で経済的であり、容易に広く利用可能な組織培養用品を使用してオービタルシェーカーの広い範囲に対応するようにスケーリングすることができる。このモデルは、生理学的および病態生理学的なレベル内に一方向と周期的流れパターンを提供するために、内皮細胞実験に適用することができます。Protocol
Representative Results
Discussion
剪断する内皮細胞を露出させるためのせん断環系の構築には、せん断応力の試験を実行する簡単な方法です。それにもかかわらず、優れたせん断リングとより良い結果を得るために重要であるいくつかのステップがあります。完全なシールは、サンプル間で矛盾したせん断応力を作成することができ漏れからメディアを防止するために、内側と外側のリングとの間になされるべきです。完全?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、氏クリストファー・グエン、アーロン・ハンターとシュリーブポートジャンプスタート、SMART、およびBiostartのトレーニングプログラムの支援だけでなく、生物物理学、シュリーブポート、LAのセンテナリー大学ルイジアナ州の部門に感謝したいです。
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
Referências
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