A Assembleia e Aplicação de 'tesoura Anéis': A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Os desvios em relação aos níveis normais e padrões de vasculares jogo cisalhamento papéis fluidos importantes na fisiologia vascular e fisiopatologia induzindo adaptativa, bem como alterações patológicas no fenótipo endotelial e expressão gênica. Em particular, os efeitos inadaptado de periódico, o fluxo unidireccional shear stress induzido pode desencadear uma variedade de efeitos sobre vários tipos de células vasculares, em particular as células endoteliais. Embora até agora as células endoteliais de diversas origens anatômicas têm sido cultivadas, análises em profundidade das suas respostas ao cisalhamento de fluidos têm sido dificultados pela relativa complexidade dos modelos de cisalhamento (por exemplo, câmara de fluxo de placas paralelas, cone e modelo de fluxo de placa). Enquanto todos estes representam excelentes abordagens, tais modelos são tecnicamente complicado e sofre de desvantagens, incluindo o tempo de configuração relativamente longo e complexo, áreas de superfície de baixo, os requisitos para bombas e pressurização muitas vezes necessitando de selantes e vedações, criando desafios para both manutenção de esterilidade e uma incapacidade de executar várias experiências. No entanto, se os modelos de taxa de transferência mais elevados de fluxo de cisalhamento e foram disponíveis, um maior progresso na cisalhamento respostas endoteliais vasculares, a pesquisa de cisalhamento particularmente periódica, a nível molecular, podem ser mais rapidamente avançada. Aqui, descrevemos a construção e utilização de anéis de corte: um romance, simples de montar, e modelo de cultura de tecido barato, com uma área de superfície relativamente grande, que facilmente permite um alto número de repetições experimentais em unidirecionais, cisalhamento periódica estudos de estresse sobre células endoteliais.
Introduction
Tensão de cisalhamento de fluidos tem sido mostrado para modular os programas de genes endoteliais 1-5 através da activação de elementos cis-reguladores 6, a actividade de acetiltransferase de histona 7 e elementos de resposta a tensão de cisalhamento (8) SSRE. Cisalhamento influências de stress contribuições endoteliais no sentido de coagulação através da modulação do factor de tecido 9 e activador do plasminogénio tecidular (tPA) 10 expressão. A tensão de cisalhamento também influencia o controle da angiogênese 11 e remodelação dos navios por regulação da síntese e capacidade de resposta 8 PDGF-B. O endoteliais derivado mediadores vasoativos adrenomedullin, a endotelina-1, urotensina II e relaxina são também regulados por cisalhamento 12. Transcrição da produção de óxido nítrico sintase endotelial e produção de óxido nítrico são ambos cisalhamento dependente 10. Cisalhamento endotelial também controla a expressão de ICAM-1 13. tensão de cisalhamento induzidas pelo fluxo pode, por conseguinte, Powerfuinfluenciar lly uma grande variedade de respostas endoteliais. Importante, pulsações vasculares agora também parecem desempenhar papéis importantes na patofisiologia de ambas envelhecimento vascular normal e formas de demência vascular 14 e pode ainda contribuir para outras doenças neurodegenerativas, tais como esclerose múltipla 15.
Venosa e células endoteliais arteriais são inerentemente expostos a diversos padrões de fluxo hemodinâmicos in vivo, e diversos fenótipos de células endoteliais diferentes pode ser exibido 16. Dependendo da magnitude e a periodicidade do escoamento, efeitos sobre as células endoteliais podem incluir a activação de células inflamatórias e de apoptose, que podem reflectir alterações no gene ou proteína de expressão 17,18. Estudos sobre as respostas das células endoteliais para tosquiar fenômenos, portanto, permanecem complicado pelas dificuldades na produção de modelos in vitro que produzem adequadamente tais padrões de cisalhamento.
Muitos experime diferentental protocolos foram desenvolvidos para aplicar a tensão de cisalhamento de fluidos para monocamadas endoteliais celulares. Um dos sistemas mais utilizados é a câmara de fluxo de placas paralelas, que cria o fluxo laminar uniforme dentro da câmara de 19-21. A bomba peristáltica está normalmente ligado para criar fluxo periódico, que pode recapitular características de fluxo tipicamente encontrados em muitos locais in vivo 22. Outra configuração comum utiliza o modelo de "cone e o prato ', onde a tensão de cisalhamento de fluidos é determinada pela velocidade de rotação do cone 23. Ambos os sistemas, e outros acordos semelhantes a eles, pode ser tedioso para configurar e requerem componentes que podem ser relativamente caros e inacessíveis para muitos laboratórios.
Outra limitação importante destes modelos actuais é o número relativamente baixo de estudos em duplicado que podem ser executadas simultaneamente, cada um com uma área superficial relativamente baixa. Isso aumenta o tempo e co mplexity de tais abordagens. Portanto, um modelo ideal que induz ao cisalhamento unidirecional e periódica pode ser aquele em que um elevado número de repetições do estudo pode ser facilmente configurado, cada um com uma área de superfície relativamente grande. Além disso, os modelos acima mencionados exigem uma configuração bastante sofisticados, que pode ser de custo proibitivo para muitos utilizadores. Um modelo que pode produzir distúrbios de cisalhamento de fluidos usando materiais básicos de laboratório pode ter várias vantagens.
Um método simples e altamente econômica de aplicar unidirecional, tensão de cisalhamento periódica envolve a colocação de pratos circulares num agitador orbital 24. Este protocolo é muito simples e pode ser escalada até atingir números elevados de estudo repetições, cada um com uma área de superfície relativamente grande, conforme necessário. No entanto, as células situadas no centro do prato são expostos a diferentes padrões de fluxo de células ao longo da periferia, dando origem a respostas celulares fenotípicas misturados no mesmo prato.
_content "> Neste relatório, nós descrevemos a construção e utilização de" anéis de corte ', o nosso modelo para a criação de tensão de cisalhamento unidirecional e periódica. O projeto para o anel de corte efetivamente fenótipos induzida por cisalhamento celulares "mistos" limites restringindo o fluxo caminho dentro de uma placa de cultura de circular para a periferia por meio da colocação de um anel interno. a construção e o funcionamento do anel de cisalhamento é simples e económico e pode ser facilmente dimensionada para acomodar uma grande variedade de agitadores orbitais usando fontes de cultura de tecidos amplamente disponíveis. Este modelo pode ser aplicado em experiências com células endoteliais para proporcionar padrões de fluxo unidireccional e periódicas dentro dos níveis fisiológicos e patofisiológicos.Protocol
Representative Results
Discussion
A construção do sistema de anel de corte durante a exposição das células endoteliais de cisalhamento é uma abordagem simples para realizar estudos de tensão de cisalhamento. No entanto, existem alguns passos que são críticos para a obtenção de anéis de cisalhamento superiores e melhores resultados. A vedação completa deve ser feita entre o anel interno e externo para evitar que materiais de vazamento que poderia criar tensão de cisalhamento inconsistente entre as amostras. Se a vedação não é feita, um…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a assistência do Sr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter eo Shreveport Jumpstart, inteligente e programas de treinamento biostart, bem como o departamento de Centenary College of Louisiana de Biofísica, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
Referências
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