Ассамблея и применение "Shear колец": Роман эндотелиальной Модель для Orbital, однонаправленные и периодического потока жидкости и напряжения сдвига
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Отклонения от нормальных уровней и форм сосудистых жидкости играть сдвига важную роль в сосудистой физиологии и патофизиологии, индуцируя адаптивными, а также патологические изменения в эндотелиальной фенотипа и экспрессии генов. В частности, неадекватные эффекты периодического, однонаправленный поток индуцированного напряжения сдвига может вызвать различные эффекты на нескольких сосудистых типов клеток, в частности эндотелиальных клеток. В то время как сейчас эндотелиальные клетки из разных анатомических происхождения культивировали, углубленный анализ их реакции на сдвиг жидкости были затруднены относительной сложности сдвига моделей (например, параллельная камера пластины потока, конус и потоковая модель пластины). В то время как все они представляют собой отличные подходы, такие модели технически сложны и страдают от недостатков, в том числе относительно длительный и сложный время установки, низкие площади поверхности, требования для насосов и давления часто требующих герметиков и прокладок, создавая проблемы для ботач поддержание стерильности и невозможностью выполнения нескольких экспериментов. Однако, если модели с более высокой пропускной способности потока и сдвига были доступны, больший прогресс на сосудистых эндотелиальных сдвиговых реакций, в частности периодические исследования сдвига на молекулярном уровне, может быть более быстро продвигались вперед. Здесь мы опишем построение и использование сдвига колец: роман, простой в сборке, а также модель недорогой тканевой культуры с относительно большой площадью поверхности, что позволяет легко для большого количества экспериментальных повторах в однонаправленных, стресс исследований периодические сдвига по эндотелиальные клетки.
Introduction
Fluid напряжение сдвига было показано , модулировать Programs эндотелиальной гена 1 – 5 через активацию цис-регуляторных элементов 6, ацетилтрансферазы активности гистона 7 продольных и поперечных элементов стрессовой реакции (SSRE) 8. Касательное напряжение , влияет эндотелиальные вклад в коагуляции путем модуляции коэффициента 9 ткани и тканевой активатор плазминогена (ТАП) 10 выражение. Напряжение сдвига также влияет на управление ангиогенеза 11 и ремоделирования сосудов, регулируя синтез PDGF-B и отзывчивость 8. Эндотелиальной производный вазоактивные медиаторы адреномедуллин, эндотелин-1, уротензин II и релаксин также регулируются сдвига 12. Транскрипция эндотелиальной синтазы производства оксида азота и оксида азота оба сдвига зависит 10. Shear также контролирует эндотелиальную ICAM-1 экспрессию 13. Flow-индуцированное напряжение сдвига, следовательно, может powerfuLLY влияют на большое разнообразие эндотелиальных реакций. Важно отметить, что сосудистые пульсации в настоящее время также , по всей видимости , играют важную роль в патофизиологии как нормальной сосудистой старения и форм сосудистой деменции 14 и даже может способствовать других нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз 15.
Венозные и артериальные эндотелиальные клетки по своей природе подвержены различным гемодинамических картины течения в естественных условиях, и много различных фенотипа эндотелиальных клеток могут быть выставлены 16. В зависимости от величины и периодичности потока, воздействие на эндотелиальных клетках , могут включать в себя активацию воспалительных клеток и апоптоз, что может отражать изменения в экспрессии генов или белков 17,18. Исследования реакций эндотелиальных клеток сдвига явления поэтому остаются сложными трудностями в производстве в моделях пробирке , которые адекватно производят такие сдвига модели.
Много различных experimental протоколы были разработаны для применения напряжения сдвига жидкости в эндотелиальные клетки монослоя. Одним из наиболее широко используемых систем является параллельная камера пластины потока, которая создает равномерный ламинарный поток внутри камеры 19 – 21. Шланговый насос обычно соединяется создать периодический поток, который может резюмировать характеристики потока , как правило , можно обнаружить во многих местах в естественных условиях 22. Другой распространенный набор использует модель 'конуса и пластины', где напряжение сдвига жидкости определяется скоростью вращения конуса 23. Обе системы, и другие механизмы, подобные им, может быть утомительным для настройки и требуют компонентов, которые могут быть относительно дорогими и недоступными для многих лабораторий.
Еще одним важным ограничением этих современных моделей является относительно низкое число повторных исследований, которые могут быть проведены одновременно, каждое с относительно низкой поверхности. Это увеличивает время и сотрудничества mplexity таких подходов. Таким образом, идеальная модель, которая вызывает однонаправленное и периодический сдвиг может быть один, где большое количество учебных повторах можно легко настроить, каждый с относительно большой площадью поверхности. Кроме того, вышеупомянутые модели требуют довольно сложной установки, которая может быть непомерно для многих пользователей. Модель, которая может производить помехи сдвига жидкости с использованием основных лабораторных материалов могут иметь ряд преимуществ.
Простой и экономичный метод весьма применения однонаправленной, периодического напряжения сдвига включает в себя размещение круговых блюд на орбитальном шейкере 24. Этот протокол очень прост и может быть расширена до достижения высоких числа обучения повторах, каждая с относительно большой площадью поверхности, по мере необходимости. Тем не менее, клетки, расположенные в центре тарелки подвергаются различным схем потока, чем клеток по периферии, что дает клеточные фенотипические смешанные реакции в том же блюде.
_content "> В этом настоящем докладе мы опишем построение и использование« сдвига колец », наша модель для создания однонаправленного и периодического напряжения сдвига. Конструкция для срезаемого кольца эффективно" смешанные "клеточные фенотипы сдвига индуцированных ограничивает, ограничивая поток путь в круговом блюдо культуры на периферии путем размещения внутреннего кольца. конструкция и функционирование срезаемого кольца является простым и экономичным и может быть легко масштабируется, чтобы приспособить широкий диапазон орбитальные шейкеры с использованием широко доступных расходных материалов тканевой культуры. в этом модель может быть применена в экспериментах эндотелиальных клеток, чтобы обеспечить однонаправленную и периодические структуры потока в пределах физиологических и патофизиологических уровней.Protocol
Representative Results
Discussion
Конструкция сдвига кольцевой системы для воздействия эндотелиальные клетки сдвига является простой подход к выполнению исследования напряжения сдвига. Тем не менее, есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для получения превосходные кольца сдвига и лучшие результаты. П…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить за помощь г-на Кристофера Нгуен, Аарон Хантер и Шривпорта Jumpstart, SMART и учебных программ Biostart, а также Столетний Колледж Луизианы отдел биофизики Шривпорте, штат Луизиана.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
Referências
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
