De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek
Summary
De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. De buffers en operatietechniek worden beschreven.
Abstract
De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. Dit is een voorwaarde voor de fysiologie van het geïsoleerde orgaan en vele innovatieve toepassingen die in de toekomst mogelijk is, zoals perfusie van cellen ontdoen van nier biotechniek of de toediening van anti-afwijzing of genoom bewerken geneesmiddelen in hoge doses prime de nier voor transplantatie. Ten tijde van de perfusie kan de nieren worden gemanipuleerd, nierfunctie meetbaar zijn en verschillende geneesmiddelen toegediend. Na de procedure kunnen de nieren worden getransplanteerd of bewerkt voor moleculaire biologie, biochemische analyse of microscopie.
Dit artikel beschrijft het perfusaat en de chirurgische techniek die nodig is voor de ex vivo perfusie van nieren muis. Details van de perfusie inrichting worden gegeven en gegevens zijn die de vANSPRAKELIJKHEID van de voorbereiding van de nieren: renale bloedstroom, vasculaire weerstand, en urine gegevens als functioneel, transmissie electronenmicroscoop van verschillende nephron segmenten als morfologische uitlezingen en western blots van transporteiwitten van verschillende nephron segmenten als moleculaire uitlezing.
Introduction
De geïsoleerde perfusie van organen is het onderwerp van een voortdurende inspanning onder fysiologen al vele tientallen jaren 1. De techniek maakt de functie van het orgaan, zonder systemische invloeden zoals bloeddruk, hormonen of zenuwen, te bestuderen. Carl Eduard Loebell wordt beschouwd als de eerste te hebben beschreef de succesvolle perfusie van een geïsoleerde nier, in 1849 2 te zijn. Sindsdien is de perfusie apparaat aanzienlijke verfijning ondergaan. Frey en Gruber introduceerde een kunstmatige long voor oxygenatie en pulserende pomp voor continue perfusie 2. Terwijl de vroege onderzoekers bestudeerden vooral de nieren van de grote zoogdieren, namelijk varkens en honden 2 3 -het eerste verslag van het gebruik van de rat nieren, door Weiss et al. , Was een mijlpaal in de studie van kleine zoogdieren-orgel perfusie 4. Schurek et al. meldde de noodzaak van het toevoegen van zoogdieren erytrocyten aan het perfusaat voldoende als tubulaireoxygenatie moest worden bereikt 5. Kritiek voor langdurige experimenten was de introductie van continue dialyse van de buffer van dezelfde onderzoeksgroep 6. In 2003, Schweda et al. waren de eersten die een geïsoleerd functionele muis doorbloed nier (MIPK) 7, later verfijnd door Rahgozar et al melden. 18 en Lindell et al. 14.
Terwijl technisch lastiger dan de rat geïsoleerde geperfuseerde nier, het gebruik van de MIPK draagt het voordeel dat het gebruik van een breed scala van genetisch gemanipuleerde muizen. Dit document geeft de details van de methode van de auteurs voor perfuseren geïsoleerde muis nieren gedurende 1 uur. De methode maakt het mogelijk voor de continue evaluatie van renale stroomsnelheid, vasculaire weerstand, afgifte van hormonen, bloed gas analyse, urine-analyse, en de toepassing van drugs. De procedure kan nieren worden verwerkt voor moleculaire en biochemische analyse, voor microscopie worden vastgesteld, ofgetransplanteerd in een ontvanger muis (Figuur 1).
Figuur 1: Overzicht van mogelijke Input / Output aan de geïsoleerde geperfuseerde nier. BGA: Blood gas analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze techniek zal waarschijnlijk krijgen steeds meer aandacht de komende jaren, zoals vele innovatieve toepassingen worden met het aanbreken van langdurige normotherme nier perfusie besproken voorafgaand aan de transplantatie (met of zonder de toepassing van anti-afwijzing of-genoom bewerken drugs) 8, 9, 10 , 11, de bioengineering van hele nieren van cellen ontdane scaffolds 12, en de toepassing van hoge doses van fluorescente kleurstoffen voor beeldvorming multiphoton 13 </sup>. Het is ook een ideaal model waarmee de rol van specifieke genen te bestuderen bij acuut nierfalen 14.
Een stap-voor-stap protocol gegeven zodat andere laboratoria geïsoleerde muizennier perfusie succes uit te voeren. Eerst wordt de samenstelling en de bereiding van de buffer opgegeven. Vervolgens wordt de operatie beschreven en de kritische stappen worden. Ten derde, gegevens worden gepresenteerd die representatief zijn voor een succesvolle voorbereiding zijn: renale bloedstroom, vaatweerstand, glomerulaire filtratiesnelheid en fractionele uitscheiding van elektrolyten-all als functionele metingen van de levensvatbaarheid-en transmissie elektronen microfoto van de morfologie van verschillende nephron segmenten van geperfundeerde nieren vastgesteld na 1 uur van perfusie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De muis die geperfuseerde nier is een hulpmiddel voor het bestuderen van nierfunctie in een gecontroleerde omgeving ex vivo gedurende 1 uur, de kloof tussen in vivo experimenten bij intacte dieren, eventueel ontsierd door de impact van talrijke systemische factoren, en in vitro experimenten geïsoleerde nefron segmenten of gekweekte cellen, die de impact van intacte orgaan structuur op de functie noodzakelijk verwaarlozen. Er is, om de kennis van de auteurs, geen alternatieve techniek waarmee …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Materials
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
Referências
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. . Über Durchströmungsapparate Pflüger’s Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger’s Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
