Nachweis von<em> Trypanosoma brucei</em> Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

Der einzelliger Parasit, Trypanosoma brucei, ist ein Erreger von Krankheiten , die Menschen (über Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense) und Tiere (über Trypanosoma brucei brucei) in ganz Afrika südlich der Sahara beeinflussen. Es ist dem Säugetierwirt durch den Speichel der Tsetse-Fliege Vektor übertragen. Mensch und Tier afrikanischen Trypanosomiasis eine schwere wirtschaftliche Belastung in Endemiegebieten verursachen, und nur wenige Medikamente zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung entweder Krankheit zu behandeln. Mechanismen der Immunumgehung zu verstehen, ist für die Entwicklung von Medikamenten für Trypanosomiasis kritisch. Antigenic Variation der dichten, Variant Oberflächen Glycoprotein (VSG) Mantel, der den Parasiten abdeckt , ist eine der wichtigsten Mittel , durch die T. brucei ausweicht die Säugetier-Antikörper – Reaktion. Ca. 2.000 Varianten des Gens VSG bestehen in Trypanosomen Genom, aber nur einer wird zu einem gegebenen Zeitpunkt transkribiert von einer ~ 15 Expression Websites. 'Switching' des exprimierten VSG kann entweder durch Kopieren eines VSG – Gens in den aktiven Expressionsstelle oder durch die Transkriptionsaktivierung eines zuvor stillen Expressionsstelle ( beschrieben in ¹⁾ auftreten.

Obwohl viel Arbeit zum Verständnis der Antigenvariation in T. gewidmet brucei, die Faktoren, die Frequenzeinfluss Schalt sind noch kaum verstanden. Bisherige Untersuchungen wurden durch die Tatsache erschwert , dass , während Schalt stochastisch in vitro auftritt, Schaltfrequenzen sehr niedrig sind, in der Größenordnung von 1 in etwa 10 ⁶ Zellen ^2. Dies macht es schwierig zu messen, ob ein gegebener Faktor erhöht oder Schaltfrequenz abnimmt, da Schalt hart ist in erster Linie zu detektieren. Vor 2009 Methoden für Switcher in einer bestimmten Population zu isolieren waren langwierig und arbeitsintensiv. Dazu gehörten Passagierung Trypanosomen durch immunisierten Mäuse gegen die herrschende VSG und dann erntet Zelleneinen Tag später ³ oder Hunderte von Zellen durch Immunofluoreszenz ^4,5 zu zählen. Eine andere Strategie stützt sich auf Auswahl für Medikamentenresistenz zu Switcher ⁶ isolieren. Da African in vitro gezüchtet Trypanosomen typischerweise aus einer großen Population gemacht werden eine wichtige Variante ausdrückt, und eine viel kleinere Population von Switcher ausdrücken alternative Varianten, verweisen wir auf die Hauptvariante in diesem Papier als dominant, beginnend VSG. Dabei wir in keiner Weise andeuten wollen, dass diese wichtige Variante mehr Fitness als andere Varianten in der Bevölkerung hat.

Hier beschreiben wir eine Methode, die die Anzahl der Trypanosomen Expression eines nicht-dominanten VSG in einer bestimmten Population in 3 zuverlässig messen kann – 4 Std. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn man will, ob eine bestimmte genetische Manipulation oder medikamentöse Behandlung zu ermitteln, die Anzahl von geschalteten Zellen in einer Population erhöht. Anstatt die Population von Zellen zu befreien, die do ausdrückenminante, beginnend VSG durch Drogen oder durch immunologische Mittel werden diese Zellen durch diese zuerst mit magnetischen Kügelchen Beschichtung eliminiert gekoppelt Antikörper gegen das dominante VSG und dann auf einem Magnet Säule isoliert. Die geschaltete Population wird dann in der Durchströmungs gesammelt und wieder gefärbt mit einem Fluorophor anti-VSG markierten Antikörper Kontaminanten zu identifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch Zugabe einer definierten Anzahl von absolute Zählung beads zu jeder Probe erreicht , so daß das Verhältnis der Kügelchen zu den Zellen bestimmt und verwendet werden können , um die Anzahl von Umschaltern in der Population ⁷ zu quantifizieren.

Protocol

ANMERKUNG: In dem Verfahren ist es notwendig, Zellen auf Eis zu halten. Kalte Medien sollten auch überall eingesetzt werden. 1. Probenernte Wachsen Lister-Stamm 427 Blutstrom Trypanosomen zu einer Dichte von 0,5 bis 1.000.000 / ml. Es ist am besten Kulturen mit einer kleinen Anzahl von Parasiten zu starten. Spin down 50 x 10 6 Zellen / Probe für 10 min bei 1500 x g. Achten Sie darauf , 1 x 10 6 Zellen in Kultur zu verlassen , für später als positive und n…

Representative Results

Die hier beschriebene Methode wurde verwendet , die Doppelstrangbrüche in der VSG Ausdruck Website zu demonstrieren stieg die Zahl der Switcher in einer Population 8. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus einer Population von Trypanosomen, die einen Doppelstrangbruch an der Expressionsstelle ähnlich induziert zu erzeugen wurden. Wir vergleichen diese Trypanosomen zu denen , die einen Doppelstrangbruch zu erzeugen , wurden nicht induziert. Abbildung 1</strong…

Discussion

In Bezug auf experimentelle Technik, die kritischste Komponente des Protokolls hält alle Proben kalt. Trypanosomen internalisieren sehr rasch Antikörper an ihre Oberfläche gebunden ^9, aber dieser Prozess ist Motilität abhängig und beeinflussen nicht den Test, solange die Zellen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Alle Proben sollten immer auf Eis gehalten werden, und Pipettieren sollte schnell Exposition zu minimieren, um die 25 ° C Laborumgebung durchgeführt werden. Kalt HMI-9 mit Serum sollte zu Beginn des…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a