påvisning af<em> Trypanosoma brucei</em> Variant overfladeglycoprotein Skift af magnetisk cellesortering og flowcytometri

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

Den protozoparasit, Trypanosoma brucei, er en agens af sygdomme, der påvirker mennesker (via Trypanosoma brucei gambiense og Trypanosoma brucei rhodesiense) og dyr (via Trypanosoma brucei brucei) i hele Afrika syd for Sahara. Den overføres til pattedyrværten gennem spyt af tsetsefluen vektor. Både menneskers og dyrs afrikanske trypanosomiasis forårsage en alvorlig økonomisk byrde i endemiske områder, og få lægemidler er tilgængelige eller under udvikling til behandling enten sygdom. Forståelse mekanismer immun unddragelse er afgørende for udviklingen af ​​lægemidler til trypanosomiasis. Antigen variation af den tætte, Variant Surface (VSG) pels, der dækker parasitten er en af de primære måder, hvorpå T. brucei undviger den mammale antistofrespons. Ca. 2.000 varianter af VSG-genet findes i trypanosominfektion genomet, men kun én transkriberes til enhver tid fra en af ~ 15 expressionens sites. "Switching" af udtrykte VSG kan ske enten ved at kopiere en VSG gen i det aktive udtryk site, eller ved transkriptionel aktivering af en tidligere tavs udtryk websted (revideret i ^1).

Selvom meget arbejde har været afsat til at forstå antigen variation i T. brucei, de faktorer, der påvirker skifte frekvens er stadig dårligt forstået. Undersøgelser til dato er blevet vanskeliggjort af, at mens skift sker stokastisk in vitro, skifte frekvenser er meget lave, i størrelsesordenen 1 i omkring 10 ⁶ celler ^2. Dette gør det vanskeligt at måle, om en given faktor stiger eller falder skifte frekvens, da skift er svært at opdage i første omgang. Før 2009, metoder til isolering omskiftere i en given population var langvarig og arbejdskrævende. Disse omfattede passage trypanosomer gennem mus immuniseret mod den dominerende VSG og derefter høste celleren dag senere ^3, eller tælle hundredvis af celler ved immunofluorescens ^4,5. En anden strategi er afhængig af selektion for resistens at isolere switchers ^6. Fordi afrikanske trypanosomer dyrket in vitro er typisk består af en stor befolkning udtrykker en større variant, og en meget mindre population af switchers udtrykker alternative varianter, henviser vi til den store variant hele dette papir som den dominerende, startende VSG. Dermed vi ikke på nogen måde ønsker at antyde, at denne store variant har større kondition end andre varianter i populationen.

Her beskriver vi en metode, som pålideligt kan måle antallet af trypanosomer udtrykker et ikke-dominerende VSG i en given population i 3 – 4 timer. Denne fremgangsmåde er særlig nyttig til, når man ønsker at konstatere, om en given genetisk manipulation eller lægemiddelbehandling øger antallet af koblede celler i en population. I stedet for at befri populationen af ​​celler, der udtrykker dominant startede VSG gennem narkotika eller ved immunologiske midler, er disse celler elimineres ved først at overtrække dem med magnetiske perler koblet til antistof mod den dominerende VSG og derefter isolere dem på en magnetisk søjle. Det koblede population opsamles derefter i gennemløbet og farvet igen med en fluorofor mærket anti-VSG-antistof til at identificere forureninger. Kvantificering opnås ved at tilsætte et defineret antal absolutte optælling perler til hver prøve, således at kan bestemmes forholdet mellem perler og celler og anvendes til at kvantificere antallet af omskiftere i populationen ^7.

Protocol

BEMÆRK: I hele den procedure, er det nødvendigt at holde celler på is. Kolde medier bør også anvendes overalt. 1. Prøve Høst Grow Lister 427 stamme blodbanen trypanosomer til en densitet på 0,5 – 1 million / ml. Det er bedst at starte kulturerne med et lille antal parasitter. Spin down 50 x 10 6 celler / prøve i 10 minutter ved 1.500 x g. Vær sikker på at efterlade 1 x 10 6 celler i kultur til senere brug som positive og negative antistof kontrolle…

Representative Results

Den her beskrevne metode blev anvendt til at påvise, at dobbelt-strenget pauser i VSG udtryk stedet øget antallet af omskiftere i en population 8. Her viser vi repræsentative resultater fra en population af trypanosomer, som er blevet tilsvarende induceres til at frembringe en dobbelt-strenget pause på ekspressionsstedet. Vi sammenligner disse trypanosomer til dem der ikke er blevet induceret til at generere en dobbeltstrenget brud. Figur 1 viser repræsen…

Discussion

Med hensyn til eksperimentel teknik, er den mest kritiske komponent af protokollen holde alle prøverne kolde. Trypanosomer meget hurtigt internalisere antistof bundet til deres overflade ^9, men denne proces er motilitet afhængig, og påvirker ikke assayet, så længe cellerne holdt ved 4 ° C. Alle prøver skal altid holdes på is, og pipettering bør ske hurtigt for at minimere eksponering for 25 ° C lab miljø. Kolde HMI-9 med serum bør være tilgængelige i starten af ​​forsøget, og bør holdes p?…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a