detecção de<em> Trypanosoma brucei</em> Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

O parasita protozoário, o Trypanosoma brucei, é um agente causador de doenças que afetam os seres humanos (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animais (via Trypanosoma brucei brucei) em toda a África Sub-Sahariana. Ele é transmitido para o hospedeiro mamífero através da saliva do vector mosca tsé-tsé. Ambos Humana e tripanossomíase Africano Animal causar uma carga económica grave em regiões endêmicas, e poucas drogas são disponíveis ou em desenvolvimento para o tratamento de qualquer doença. Compreender mecanismos de evasão imunitária é crítico para o desenvolvimento de drogas para a tripanossomíase. A variação antigênica do revestimento denso, Variante glicoproteína de superfície (VSG) que cobre o parasita é um dos meios primários pelos quais T. brucei evita a resposta do anticorpo de mamífero. Cerca de 2000 variantes do gene VSG existem no genoma tripanossoma, mas só um é transcrito em qualquer momento a partir de uma de ~ 15 expresSites SION. 'Comutação' da VSG expresso pode ocorrer quer por cópia de um gene de VSG no local de expressão activa, ou por activação da transcrição de um local de expressão anteriormente silenciosos (revisto em ^1).

Embora muito trabalho foi dedicado à compreensão variação antigênica em T. brucei, os fatores que influenciam a freqüência de comutação são ainda pouco compreendidos. Estudos até à data têm sido dificultados pelo fato de que, enquanto a comutação ocorre estocasticamente in vitro, freqüências de chaveamento são muito baixos, da ordem de 1 a cerca de 10 ⁶ células ^2. Isso torna difícil para medir se um fator dadas aumenta ou diminui frequência de comutação, uma vez que a mudança é difícil de detectar, em primeiro lugar. Antes de 2009, os métodos para isolar switchers em uma dada população foram longo e trabalhoso. Estas células Passaging tripanossomas através de ratinhos imunizados contra o VSG dominante e em seguida colhem incluídosum dias mais tarde ^três, contando ou centenas de células por imunofluorescência ^4,5. Outra estratégia baseia-se na seleção para resistência a drogas para isolar switchers ^6. Porque tripanossomas africanos cultivadas in vitro são geralmente composta de uma população grande expressando uma variante importante, e uma população muito menor de switchers que expressam variantes alternativas, referimo-nos à grande variação ao longo deste artigo como o, VSG começando dominante. Ao fazê-lo, nós, de modo algum pretendo afirmar que este importante variante tem maior aptidão do que outras variantes na população.

Aqui nós descrevemos um método que pode medir de forma confiável o número de tripanossomas expressando um VSG não dominante numa dada população em 3-4 horas. Este método é particularmente útil para quando se quer determinar se um dado manipulação genética ou tratamento medicamentoso aumenta o número de células ligadas em uma população. Em vez de libertar a população de células que expressam a fazerminant, começando VSG através de drogas ou por meios imunológicos, estas células são eliminadas por primeiro revestindo-os com pérolas magnéticas acopladas a anticorpos contra a VSG dominante e em seguida isolá-los sobre uma coluna magnética. A população ligado é então recolhido no fluxo de passagem e coradas novamente com um anticorpo marcado com fluoróforo anti-VSG para a identificação de contaminantes. A quantificação é conseguida através da adição de um número definido de pérolas de contagem absoluta de cada amostra de modo que a razão de pérolas para células pode ser determinada e utilizada para quantificar o número de comutadores na população ^7.

Protocol

NOTA: Durante o procedimento, é necessário manter as células no gelo. media frias também devem ser utilizados por toda parte. Colheita 1. Amostra Crescer Lister 427 tripanossomas tensão da corrente sanguínea até uma densidade de 0,5 – 1 milhão / ml. É melhor iniciar culturas com um pequeno número de parasitas. Girar 50 X 10 6 células / amostra durante 10 min a 1500 x g. Certifique-se de deixar 1 x 10 6 células em cultura para mais tarde usar contr…

Representative Results

O método aqui descrito foi utilizado para demonstrar que as quebras de cadeia dupla no interior do local de expressão VSG aumentou o número de comutadores numa população 8. Aqui, mostramos resultados representativos de uma população de tripanossomas que têm sido igualmente induzidos para gerar uma ruptura de fita dupla no local expressão. Nós comparar estes tripanossomas para aqueles que não tenham sido induzidas a gerar uma ruptura de fita dupla. A Figura 1…

Discussion

No que diz respeito à técnica experimental, o componente mais importante do protocolo é manter todas as amostras frias. Tripanossomas internalizar muito rapidamente anticorpo ligado à sua superfície ^9, mas este processo é dependente da motilidade, e não influencia o ensaio, enquanto as células são mantidas a 4 ° C. Todas as amostras devem sempre ser mantidos em gelo, e pipetagem deve ser feito rapidamente para minimizar a exposição ao ambiente C laboratório 25 °. Frio HMI-9 com soro deve estar d…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a