유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정
Summary
속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.
Abstract
Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.
Introduction
이 문서는 기존의 유동 세포 계측법 기술을 사용하여 재조합 세포에서 발현 이온 통로와 같은 막 단백질의 상대적인 세포 표면 발현을보고 신뢰성 분석을 제공한다. 이온 채널은 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 게이팅함으로써 전기 신호를 제어 할 책임이 조공 막 단백질이다. 그들은 활성화 메커니즘, 자연, 그들이 지역화 된 구멍을 통해 환승 이온 종의 선택에 의해 분류된다. 세포 및 조직 수준에서 이온 채널을 통해 거시적 인 이온 플럭스는 생물 물리학 (게이팅 및 침투), 생화학 (인산화) 및 생합성 (합성, 글리코 실화, 인신 매매 및 저하) 특성 (1)의 제품이다. 이러한 프로세스 각각은 이온 채널의 모든 유형에 고유 한 이온 채널의 생리적 역할을 수행하도록 최적화된다. 결과적으로,을 통해 이러한 미세 조정 과정 중 어느 하나의 변경상속 또는 종종 "channelopathy"이라 유전 적 변형은 세포 항상성에 해로울 수있다. 이는 세포 표면에서 이온 채널의 "오른쪽"양을 전달하는 것은 세포의 항상성에 중요한 것을 강조하는 것이 중요하다. 심지어 작은 증가 (기능 획득) 및 이온 채널 활성의 저하가 적은 (기능 상실) 일생 심각한 병리를 유발할 수있다. 성숙한 이온 채널의 세포 표면 전달의 결함은 낭포 성 섬유증 (CFTR 이온 채널) 2 긴 QT 증후군 양식 (심장 칼륨 채널) (3) 심장 부정맥 등 수많은 channelopathies에서 결정하는 중요한 요소이다.
Channelopathies은 심장 돌연사 (4)와 연결되어 있습니다. 2,000-1 : 개인 5 당 3,000 갑작스런 부정맥 심장 죽음 캘리포니아의 약 절반에 대한 책임이 있습니다 모든 심장 channelopathies의 현재 전 세계적으로 유병률은 적어도 한 것으로 생각된다SES 6. 심장 전압 게이트 된 나트륨, 칼륨 -에 장애, 및 칼슘 – 선택적인 이온 채널은이 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. L 자 형 칼슘 1.2 V 전압 게이트 된 칼슘 채널 동기화 심장 근육의 수축을 개시해야한다. 심장 L 형 칼슘 채널 1.2 V 보조 소단위 7-12 α2δ1 주 조공 칼슘 V의 α1 서브 유닛 및 CA V의 ß 및 CA V 이루어지는 다중 서브 유니트 단백질 복합체이다. 이들 서브 유닛은 심장 (13)의 통상의 전기 기능을 지원하는 데 필수적인 보조 서브 유닛 사이의 완전한 보완은 세포막에 작용 칼슘 V 1.2 채널의 동적 상호 작용을 생성 할 필요가 있습니다. 칼슘 V의 ß는 칼슘 V의 세포 표면 발현을 비공유 나노 몰 소수성 상호 작용 (14)를 통해 1.2 채널을 촉진한다. 칼슘의 V α2δ1 서브 유닛 위스콘신의 공동 발현일 칼슘 V의 ß-결합 된 칼슘 V의 α1은 피크 전류 식 (5 ~ 10 배까지)를 자극하고 더 음의 전압에서 채널 활성화를 촉진한다. 기능 획득 칼슘 V 1.2은 L 형 칼슘 V 1.2 채널을 형성하는 세 개의 주요 소단위에서 점 돌연변이의 호스트 반면 긴 QT 증후군 15라는 심실 부정맥의 형태와 연관되어있는 조공 단위체의 돌연변이 짧은 QT 증후군 양식 (16, 17)의 부정맥을 앓고있는 환자에서 확인되었다. 이온 채널은 생화학 적 관점 (단백질 화학)에서 조사 또는 이러한 보완적인 접근 방식을 사용하여 자주 전기 생리 도구 (전류 생성 기계) 등을 사용 할 수 막 단백질이다. 전기 생리학, 특히 전체 셀 패치 클램프에, 이온 채널 (15)의 기능을 규명하는 적합한 방법이지만, 자신의 생물 물리학 적 변화에서 단백질 인신 매매에 수정 사항을 해결할 수속성. 단백질 화학 그러나 인해 종종 작은 가용성 단백질에 비해 큰 막 단백질의 상대적으로 낮은 발현에 사용을 제한하고있다. 형광 판독을 사용하여 강력한 높은 처리량 방법은 특별히 이온 채널의 세포 표면 발현의 변화를 유발 단백질 생합성에서의 결함을 해결하기 위해 개발 될 필요가있다.
유동 세포 계측법은 셀 카운팅 정렬 바이오 마커 검출, 단백질 공학 (18)에 이용되는 생물 물리학 적 기술이다. 생균 또는 입자의 샘플 용액을 플로우 사이토 미터에 주입하는 경우, 셀은 시스템의 감지 장치 (도 1)로 탐색 할 수있는 단일 스트림으로 순서화된다. 1956 (19)에서 생산 기기 사이토 제 1 유로는 단지 하나의 파라미터를 감지하지만 현대 유동 세포 계측기 여러 레이저와 30 개 이상의 형광 파라미터 (20, 21)의 검출을 허용 형광 검출기를 갖는다.필터 및 거울 (발광 광학)의 강도에 비례하여 빛을 변환하는 전자 네트워크 (포토 다이오드 및 감지기)에 세포의 빛 산란이나 형광등을 직접. 디지털 데이터는 특수한 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 기본 출력 도트 플롯 (21)로 표시된다.
그림 1. 유동 세포 계측법 생물 물리학 원리 정렬이 단일 세포가 하나 이상의 레이저 질의 포인트를 가로 질러 이동 시스 유체 스트림 내의 고압 노즐을 통해 가압된다. 광 빔이 통과하는 세포에 의해 편향되고, 순방향 (순방향 산란 FCS)에 수집 된 광은 셀의 크기에 비례 한 신호로 변환하는 광 다이오드로 전송된다. 빛은 레이저 경로에 90 ° 각도로 수집 감지기 (또한 광전자 증 배관 (PMT))로 전송됩니다.여기 된 형광 색소는 상기 셀에 존재하는 경우,이 광은 셀 내의 입도를 반영 측면 산란 신호 (SSC)의 검출을 허용 이색 거울, 형광 방출을 통해 라우팅된다. 세 검출기 (녹색, 황색, 및 빨강)은 상이한 형광 색소를 동시에 검출 할 수 있도록, 서로 다른 파장 대역 통과 필터들로 표현된다. 서로 다른 신호는 외부 컴퓨터에 의해 디지털화하고 세포의 특성을 정량화 분석 할 데이터로 변환된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유동 세포 계측기의 높은 처리량은 재조합 야생형과 피킹 결핍 전압 게이트 된 L 형 칼슘 채널 및 1.2 V 생균에 연결된 소단위의 상대 세포막 발현을 정량화 시키는데 이용되었다. cDNA를 공동 구축단백질에 대한 딩은 이중으로 동시에 불 투과성 형광 접합 된 항체와 구조적으로 형광 세포 내 형광 검출 할 수있는 세포 외 비 형광 에피토프를 수행하기 위해 태그되었습니다. 모두 C 말단에 삽입 한 후, 단백질의 세포 외 루프에 삽입 된 세포 에피토프 및 형광 세포가 단백질로 번역된다. 이러한 일련의 실험에서, 칼슘 V의 α2δ1 단백질 고유 세포 형광 항 – HA 및 mCherry를 π 공역 계 세포 외 헤 마글 루티 닌 (HA) 에피토프 불 침투성 FITC (플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트)에 의해 검출 (YPYDVPDYA)을 발현하도록 설계 하였다. mCherry – 칼슘 V의 α2δ1 HA 표지 된 단백질의 상대적인 세포 표면 발현 레벨을 결정하기 위해, 융합 단백질을 발현하는 재조합 세포를 형질 전환 한 후 수확하고, FITC 접합 마우스 단일 클론 항 HA 에피토프 태그 antibod 염색 하였다Y (그림 2). FITC 따라서 생물학적 기능을 방해하는 등의 가능성이없는 효소 리포터보다 상당히 작고, 형광 유기 화합물이다. TSA-201cells에서 과발현 mCherry- 칼슘 α2δ1 V-HA는 이차원 플롯 (22)에 대한 FITC 형광 및 mCherry 형광 크게 3 로그의 증가를 생성한다. 는 HA 에피토프는 단백질의 세포 외 부분에 위치되는 것을 감안할 때, FITC에 대한 형광 강도는 손상 세포의 존재 하에서 얻어진 HA 표지 된 단백질의 세포 표면 발현의 상대적인 인덱스를 반영한다. 작 제물의 HA 에피토프의 접근성 체계적 셀 permeabilization 후 FITC 신호를 측정함으로써 확인된다. FITC 형광에 대한 상대 강도가 상대적 형광 값 FO한다 질적 비교 투과성이 세포에서 예상 때문에 계수는 정규화 된 총 단백질 발현을 확증하는 역할R mCherry은 투과성이 비 투과성이 조건 22, 23에서 측정. 이는 고유의 형광 스펙트럼 permeabilization 후 높은 값 측으로 시프트되어 있지만, 상기 제어 구조에 비해보고되는 유일한 값 형광 강도의 변화가 있음을 주목하는 것이 중요하다. 테스트 구조에 대한 형광 세기의 상대적 변화는 각 형광 물질 (FITC 또는 mCherry)에 ΔMean 형광 강도 (ΔMFI) 값을 사용하여 추정된다. 실험 형광 접합 된 항체의 고유 형광 실험 변동을 제한하기 위해 동일한 조건 하에서 발현 제어 구조의 형광 강도의 테스트 구조의 상대적 형광 강도를 측정하도록 설계된다. 두 개의 막 단백질이 성공적이 분석을 이용하여 검토했다 : L 형 전압 게이트 된 칼슘 채널 칼슘 1.2 V 14, 22 및 다른 일련의 조공 소단위실험, 세포 외 보조 칼슘 V의 α2δ1 서브 유닛 22, 23. 다음 프로토콜은 1.2 채널의 제어 조건에서 이온 채널의 번역 후 변형에 영향을 미치는 돌연변이 후에 심장 L 형 칼슘 V의 칼슘 V의 α2δ1 서브 유닛의 세포 표면 발현을 측정 하였다. 표준 실험 조건하에 FITC의 세포 표면 형광은 mCherry – 칼슘 α2δ1 V-HA 단백질 (참조 (22)로부터도 5)을 코딩하는 cDNA의 발현과 유사 선형 증가한다.
그림 2 :. 실험 프로토콜 유동 세포 계측법 총 멤브레인 라벨의 도식 표현 계획은 필요한 주요 단계 중 일부는 플로리다에 의해 재조합 이온 채널의 상대적인 총과 세포 표면 발현을 정량화 설명유동 세포 계측법. 셀 (1)은 TSA-201 세포에서 이중 태그 구조 mCherry – 칼슘 α2δ1 V-HA 형질 permeabilization과 전 또는 후에 염색 (2). (3) 다변량 분석 (4). 사이토 다중 매개 데이터 흐름에 취득 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 유동 세포 계측법 기반 분석은 성공적 전압 게이트 된 칼슘 채널 14,22,26의 조공 – 형광 표지와 연관된 서브 유닛의 상대적 총 세포 표면 수준의 측정에 적용했다. 이것은 유전 적 돌연변이의 영향을 조사 할 때 가장 사용함으로써 표지화 – 형광 태그 야생형 구조체의 내재적 형광 강도는 형광 표지 된 태그가없는 구조의 형광 강도보다 큰 100 배, 적어도 10 인 것이 요구되고 . 이 특정 예에…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Serge Sénéchal and Dr. Jacques Thibodeau for sharing their expertise and granting us access to their flow cytometry and cell sorting platform. This work was completed with the operating grant 130256 from the Canadian Institutes of Health Research, a grant-in-aid from the Canadian Heart and Stroke Foundation, and support from the “Fondation de l’Institut de Cardiologie de Montréal” to L.P.
Materials
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523). |
| Tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Disposable graduated Tranfer Pipets | VWR | 160001-192 | |
| 100-mm culture dish | Corning | 430167 | For standard culture of HEKT cells. |
| 35-mm culture dish | Falcon | 353001 | For standard culture of HEKT cells. |
| Serological pipette 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Serological pipette 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipette 25ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco's high-glucose medium | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin-EDTA (1X) 0.05%, phenol red | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Fisher | BP661-10 | Can be "home-made". |
| Anti-HA FITC conjugated antibody | Sigma | H7411 | |
| IgG1−FITC Isotype Control antibody | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C. |
| Hemacytometer | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | To access cell viability. |
| Refrigerated Microcentrifuge, 5430R | Eppendorf | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Flow cytometer. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | For data analysis. |
Referências
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