Descrevemos um protocolo para filtração de amostras de água com um cartucho de filtro e extração de DNA ambiental (eDNA) sem ter que abrir a caixa para remover o filtro. Este protocolo é desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável a eDNA de outros organismos.
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Artigo de método
O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudos recentes demonstraram que o uso de DNA ambiental (eDNA) de peixes é apropriado como uma ferramenta de monitoramento não invasiva. A maioria desses estudos empregou filtros de fibra de disco para coletar eDNA de amostras de água, embora vários estudos microbianos em ambientes aquáticos tenham empregado cartuchos de filtro, porque o cartucho tem a vantagem de acomodar grandes volumes de água e de facilidade geral de uso. Aqui, fornecemos um protocolo para filtração de amostras de água usando o cartucho do filtro e extração de eDNA do filtro sem ter que abrir a carcaça. As principais partes deste protocolo consistem em 1) filtração de amostras de água (volumes de água ≤4 L ou >4 L); (2) extração de DNA no filtro usando um agitador de rolos colocado em uma incubadora pré-aquecida; e (3) purificação do DNA usando um kit comercial. Com o uso deste e de protocolos usados anteriormente, realizamos análises de metabarcoding de eDNA retirado de um enorme tanque de aquário (7.500 m3) com composição de espécies conhecidas, e mostramos o número de espécies detectadas por biblioteca dos dois protocolos como resultados representativos. Este protocolo foi desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável ao eDNA de outros organismos.
Introdução
DNA Ambiental (Edna) em ambientes aquáticos refere-se a material genético encontrado na coluna de água. Estudos recentes demonstraram a utilidade de Edna para a detecção de peixes de vários ambientes aquáticos, incluindo lagoas 1-3, 4-8 rios, córregos 9, e água do mar 10-14. A maioria destes estudos focados em detecção de um único ou poucos invasiva 1,4-6,8,14 e raras ou ameaçadas espécies de 3,9, enquanto alguns estudos recentes tentativa de detecção simultânea de múltiplas espécies em comunidades de peixes locais 7,9, 12,13,15 e mesocosmos 11,12.
A ú....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo não lidar com métodos de amostragem de água e metabarcoding. A água pode ser colhidas amostras de diferentes maneiras, dependendo fins de estudo 16 e veja Miya et al. 12 para detalhes dos métodos metabarcoding usando primers MiFish. Note-se que a água amostra deve ser mantido muito frio e filtrou-se dentro de algumas horas para evitar a degradação de EdNA. Observe também que este protocolo envolve o uso de um agitador rotativo e uma incubadora, e este último deve ser grande o suficiente para acomodar o ex. Além disso, uma centrifugadora que pode acomodar-se a 15 ml e 50 ml de tubos cónicos é indispensável para remov....
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Resultados
É tecnicamente difícil isolar e quantificar única Edna peixe da Edna volume extraído, porque os primers MiFish coamplify região alvo de alguns vertebrados não-peixes, tais como aves e mamíferos, com produtos de PCR do mesmo tamanho (ca. 170 pb ) 12. Em vez de quantificar peixes Edna, realizamos MiFish metabarcoding análise de Edna de um tanque do aquário com composição de espécies conhecidas usando dois métodos diferentes de filtração e extracção do ADN e comparar os .......
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Discussão
Em muitos estudos metabarcoding utilizando amostras ambientais, tais como a água eo solo, tratamento pós-filtração do cartucho de filtro é geralmente da seguinte forma 24,25: 1) o corte aberto ou fissuras da caixa com ferramentas manuais (cortador de tubos ou um alicate); 2) remoção do filtro a partir do cartucho; e 3) o filtro de corte em pedaços pequenos com uma lâmina de barbear para a extracção do ADN. Para evitar tais pesado e procedimentos que são propensas à contaminação no laboratório demorado, nós te.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado como pesquisa básica pelo CREST da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JST) e por doações da JSPS/MEXT KAKENHI (Número 26291083) e da Fundação Canon para M.M. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Painel de malha | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Pino de metal | Iris Ohyama | MR12F | |
| Suporte para o painel de malha | Sem marca | 4184-9507 | disponível na Amazon Japan |
| Saco plástico de 1 L com tampa de rosca | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Conector luer-lock macho | ISIS | 11620 | |
| Ponta de pipeta de 10 ml | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| Garrafa de livro de 10 L com válvula | As One | 1-2169-01 | |
| Filtro Sterivex-HV | Millipore | SVHVL10RC | indicado como "cartucho de filtro" em todo o ms e usado no protocolo |
| Conexão luer macho | As One | 1-7379-04 | |
| Conexão luer fêmea | As One | 5-1043-14 | |
| Tampa luer de entrada | ISIS | VRMP6 | |
| Tampa luer de saída | ISIS | VRFP6 | |
| Tubulação de alto vácuo | como um | 6-590-01 | |
| Conector de vácuo | como um | 6-663-02 | |
| Rolha de silicone | como um | 1-7650-07 | |
| Manifold | como um | 2-258-01 | |
| Aspirador-GAS-1 | Como Um | 1-7483-21 | |
| DNeasy Sangue & Kit de Tecido (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex Kit de Isolamento de DNA | MO BIO | 14600-50-NF | indicado como "kit opcional" no ms |
| Centrífuga de Mesa | Kubota | Modelo 4000 | Velocidade máxima 6.000 rpm |
| Rotor de ângulo fixo Adaptador | Kubota | AT-508C | |
| para um tubo cônico de 15 ml | Kubota | 055-1280 | |
| Solução de estabilização de RNAlater | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denotado como "filme autovedante" |
Referências
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE....
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Reimpressões e permissões
