Användning av en filterpatron för filtrering av vattenprover och utvinning av miljö DNA

Summary

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduction

Miljö DNA (eDNA) i vattenmiljöer avser genetiska material som finns i vattnet. Nya studier har visat användbarheten av eDNA för detektering av fiskar från olika vattenmiljöer, inklusive dammar ^1-3, floder ^4-8, strömmar ^9, och havsvatten ^10-14. De flesta av dessa studier fokuserade på detektion av en enda eller ett fåtal invasiv ^1,4-6,8,14 och sällsynta eller hotade arter ^3,9, medan några nya studier försökt samtidig detektion av flera arter i lokala fisksamhällen ^{7,9, 12,13,15} och mesokosmosstudier ^11,12.

Den senare metoden kallas "metabarcoding" och Edna metabarcoding använder en eller flera uppsättningar av PCR-primers för att coamplify en genregion över taxonomiskt skilda prover. Detta följs av biblioteket förberedelse med indexering och adapter dessutom och indexerade bibliotek analyseras av en hög genomströmning parallell sekvenseplattform. Nyligen Miya et al. ¹² utvecklade universella PCR-primers för metabarcoding eDNA från fiskar (kallas "MiFish"). De MiFish primers rikta en hypervariabel region av den mitokondriella 12S rRNA-genen (163-185 bp), som innehåller tillräcklig information för att identifiera fiskar till taxonomiska familj, släkte och art, utom för vissa närbesläktade kongener. Med hjälp av dessa primers i Edna metabarcoding, Miya et al. ¹² upptäckt mer än 230 subtropiska marina arter från akvarier med kända artsammansättning och korallrev i närheten akvariet.

Medan optimera metabarcoding protokollet att rymma naturliga havsvatten med olika nivåer av eDNA koncentration från fiskar, har vi märkt att MiFish primers ibland misslyckades att förstärka målområdet för efterföljande bibliotek beredning. En av de mer troliga orsakerna till detta misslyckade PCR-förstärkning är brist på tillräckliga mängder av template DNA som finns i små mängder vatten filtrerade (dvs 1-2 L). Även eDNA koncentration från en viss taxonomisk grupp är omöjlig innan förstärkning, filtrering av stora vattenvolymer (> 1-2 L) skulle vara ett enkelt och effektivt sätt att samla in mer eDNA från vattenmiljöer med knappa fisk förekomst och biomassa, såsom öppen havet och djuphavsekosystem.

I förhållande till skivfiberfilter som konventionellt används i ett antal fiskar eDNA forskning ^16, filterpatroner har fördelen att ta emot större vattenvolymer innan igensättning ^17. Egentligen en nyligen genomförd studie visade stor volym (> 20 L) filtrering av kusthavsvattenprover som använder filterpatroner ^18. Dessutom, de är individuellt förpackade och steril, och flera steg av den experimentella arbetsflödet kan utföras i filterhuset, vilket minskar sannolikheten för kontaminering från laboratoriet ^19. Den senareFunktionen är avgörande för eDNA metabarcoding, där risken för kontaminering är fortfarande bland de största experimentella utmaningar ^20,21. Trots dessa tekniska fördelar av filterpatroner, har det inte använts i Edna studier av fiskar med två undantag ^8,15.

Här ger vi ett protokoll för filtrering av vattenprover med filterpatronen och utvinning av eDNA från sin filter utan att behöva skära upp höljet. Vi tillhandahåller också två alternativa vattenfiltreringssystem beroende på volymer vatten (≤4 L eller> 4 L). För att jämföra prestanda nyutvecklade protokoll och en tidigare protokoll som används med hjälp av en glasfiberfilter i vår forskargrupp ^12,14,22,23, vi utför eDNA metabarcoding analys av havsvatten från en enorm akvarium (7500 m ³ ) med känd artsammansättning och visar antalet upptäckta arter som härrör från de två protokoll som representativa resultat. Detta protokoll hsom utvecklats för metabarcoding eDNA från fiskar, men är också tillämpbar på eDNA från andra organismer.

Protocol

OBS: Detta protokoll behandlar inte vatten provtagning och metabarcoding metoder. Vatten kan provtas på olika sätt beroende på studiesyfte 16 och se Miya et al. 12 för detaljer om metabarcoding metoder med användning MiFish primers. Observera att den samplade vattnet bör hållas mycket kallt och filtreras inom några timmar för att undvika nedbrytning av eDNA. Notera också att detta protokoll innefattar användning av en roterande skakanordning och en inkubator, och den senare mås…

Representative Results

Det är tekniskt svårt att isolera och kvantifiera bara fisk eDNA från den extraherade bulk eDNA eftersom MiFish primers coamplify målområdet från vissa icke-fisk ryggradsdjur, såsom fåglar och däggdjur, med PCR-produkter av samma storlek (ca. 170 bp ) 12. I stället för att kvantifiera fisk eDNA utför vi MiFish metabarcoding analys omEdna från ett akvarium tank med känd artsammansättning med hjälp av två olika metoder för filtrering och DNA-extraktion…

Discussion

I många metabarcoding studier med miljöprov såsom vatten och mark, är i allmänhet efterfiltreringsbehandling av filterpatronen enligt följande ^24,25: 1) skära upp eller sprickbildning huset med handverktyg (slang cutter eller tång); 2) avlägsnande av filtret från patronen; och 3) att skära filtret i små bitar med ett rakblad för DNA-extraktion. För att undvika sådana besvärliga och tidskrävande förfaranden som är benägna att kontaminering i laboratoriet, har vi försökt flera DNA extrakti…

Materials

Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1-L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10-mL pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10-L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 mL conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"