A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in<em> Drosophila</em
Summary
Hier presenteren we een methode om organismal vetgehalte in het derde instar (L3) larvale stadium van Drosophila melanogaster gemeten. Deze methode maakt gebruik van de relatief lage dichtheid van vetweefsel om onderscheid te maken tussen de larven met gewijzigde vetreserves. Drijfvermogen gebaseerde analyse is een waardevol hulpmiddel voor snelle, reproduceerbare en economisch screening.
Abstract
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Introduction
Drosophila melanogaster is gebruikt voor meer dan een eeuw in de studie van de genetica en andere fundamentele biologische vragen. In de afgelopen decennia is duidelijk geworden dat Drosophila is een krachtig instrument in de studie van vele ziekten bij de mens. 70 – 80% van de genen geassocieerd met ziekten bij de mens een geïdentificeerde fly ortholoog 1-4, Drosophila biedt een vereenvoudigde, doch vertaalbare systeem om complexe ziekten te bestuderen. Metabolisme in het bijzonder heeft geprofiteerd van een dergelijke studie. Niet alleen zijn de genetica van metabolisme goed geconserveerd tussen vliegen en mensen, maar de betrokken organen en celtypen zijn ook vergelijkbaar 2,5. Bijvoorbeeld, het vet lichaam van de vlieg winkels zowel triacylglyceriden (TAG) en glycogeen, functioneert analoog met die welke in zoogdierlijke lever en wit vetweefsel 6. Met behulp van Drosophila als model voor humane obesitas is enorm verbeterd ons begrip van lipidemetabolisme en de genetica van obesitas 7. Het larvale stadium van ontwikkeling is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de scheiding van voedingsmiddelen bij opslag en gebruik zoals het is gewijd aan voeding en energieopslag in verpopping te gebruiken.
Momenteel zijn er veel verschillende kwantitatieve werkwijzen voor het bepalen vetopslag niveaus in Drosophila. De meest gebruikte methode is de gekoppelde colorimetrische assay (CCA) 8,9. CCA is ontwikkeld voor het bepalen TAG niveaus in serum en werkt op de vooronderstelling dat glycerol bevrijd van de ruggengraat van triglyceriden De volgende reacties ondergaan uiteindelijk resulteert in een redox-gekoppelde reactie opwekken van een gekleurd product. De absorptie van specifieke golflengten van licht wordt dan gemeten op de aanvankelijke hoeveelheid glycerol aanwezig bepalen. Echter, kan glycerol worden bevrijd van mono- en diacylglycerides naast TAG en derhalve kan geen nauwkeurige maat s bedragentroleerd lichaamsvet 9. Bovendien kan oog pigment gemalen volwassen vliegen storen met absorptie lezingen en compliceren resultaten 9,10. Daarom moet CCA vergezeld en gevalideerd door dunnelaagchromatografie (TLC), waardoor de scheiding van de meeste families lipide dat kan worden gekwantificeerd met densitometrie 10,11. Echter, sommige lipide klassen zoals sterolen niet worden geanalyseerd en moeten op een andere manier 12 worden gekwantificeerd. Massaspectrometrie (MS) is een nauwkeurige manier om alle klassen van de grote mobiele lipiden 12,13 kwantificeren. Echter, de lipide-extractie procedures die nodig zijn om te analyseren door MS zijn zowel tijdrovend (de meeste nemen bijna een hele dag) en kostbaar. Hier geven we een alternatieve methode om snel en goedkoop organismale vetgehalte bepalen de L3 larven van Drosophila melanogaster.
De methode hieronder maakt gebruik van het verschil in dichtheid tussen vetweefsel en mager weefsel. Mammalian fat weefsel heeft een dichtheid van ongeveer 0,9 g / ml 14 terwijl skeletspier een dichtheid van 1,06 g / ml 15. Dit verschil betekent dat dieren met hogere slaat vet lagere dichtheid dan dieren met een lagere winkels vet, waardoor ze beter zweven in een oplossing van vaste dichtheid hebben. Deze eigenschap maakt extreem snelle screening van een groot aantal dieren terwijl zowel goedkoop en niet-invasief. Drijfvermogen gebaseerde analyse is gebruikt om zowel de fenotypen van wijziging bekende regulatoren van vetgehalten en om nieuwe genetische en neurologische regulatoren identificeren van obesitas 16,17 bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een groot aantal technieken die zijn ontwikkeld om lipiden te meten 8-10. Echter, elk van deze methoden geleverd met een aantal belangrijke nadelen zijn die onder het drijfvermogen gebaseerde test hierboven beschreven. Ten eerste, deze test is erg snel. Het testen van een volledige concentratie gradiënt duurt niet langer dan 30 – 60 min. Dit is een enorme verbetering ten opzichte van de meeste van de technieken die momenteel worden gebruikt. Bijvoorbeeld lipide kwantificering do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Materials
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |
Referências
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
- Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
- Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
- Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
- Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).
- Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
- Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
- Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).
- Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
- Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
- Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
- Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
- Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
- Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
- Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).
- Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
