وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em> في المختبر</em> مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية
Summary
يصف هذا البروتوكول غير مباشر coculture الخلايا العصبية نجمية لتحليل مجزأة التفاعلات العصبية، الدبقية.
Abstract
تطوير الخلايا العصبية السليمة وظيفة هو شرط أساسي للبلدان النامية والدماغ الكبار. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء تشكيل رقابة شديدة وصيانة شبكات العصبية معقدة وغير مفهومة تماما حتى الآن. الأسئلة المفتوحة المتعلقة الخلايا العصبية في الصحة والمرض متنوعة وتمتد من فهم التنموية الأساسية للتحقيق في الأمراض المتعلقة البشرية، على سبيل المثال، مرض الزهايمر والفصام. التحليل الأكثر تفصيلا من الخلايا العصبية يمكن أن يؤديها في المختبر. ومع ذلك، الخلايا العصبية يطالبون الخلايا وبحاجة إلى دعم إضافي من الخلايا النجمية من أجل البقاء على المدى الطويل. هذا التباين الخلوي في الصراع بهدف تشريح تحليل الخلايا العصبية والخلايا النجمية. نقدم هنا مقايسة لزراعة الخلايا التي تسمح لاستنبات مشترك طويل الأجل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية الأساسية النقية، التي تشترك في نفس المتوسطة محددة كيميائيا، في حين يجري جسديامنفصل. في هذا الإعداد، والثقافات البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع، والاختبار هو مناسبة لمجموعة متنوعة من التحقيقات بشأن تفاعل الخلايا العصبية الدبقية.
Introduction
طوال العقود الماضية، والتفسير العام للوظيفة دبق عصبي قد تطورت من إسناد من مجرد داعم نحو دور تنظيمي فعال بشأن وظيفة الخلايا العصبية 1. لما له من تأثير بارز على توازن الدماغ في الصحة والمرض 2، النجمية ذات أهمية خاصة بالنسبة للمجتمع العلمي. في السنوات القليلة الماضية، ركزت مجموعة متنوعة من الدراسات حول تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية في المجراة في المختبر 3. ومع ذلك، فإن معظم أنظمة الثقافة لا تسمح لتحليل منفصل كل أنواع الخلايا وsecretomes كل منهما.
عدة نهج تستغل استنبات مشترك المباشر من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية لتحقيق بقاء طويل الأمد وتطوير الشبكة العصبية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 4-6. هذا البروتوكول تصل إلى نفس الأهداف مع الحفاظ على حد سواء أنواع الخلايا فصلها فعليا 7. مقارنة مع مكيفاتالنهج د المتوسطة 8،9، نظامنا يسمح لدراسة الاتصال ثنائي الاتجاه بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية. يمكن رصد التعبير عن جزيئات يشير يفرز في حين ينضج الخلايا في الوسيط المشترك. هذه الفرصة هي ذات الصلة وخاصة، كما تطلق الخلايا النجمية العوامل القابلة للذوبان، مثل السيتوكينات وعوامل النمو والجزيئات المصفوفة خارج الخلية 10،11، وبالتالي تنظيم نمو الخلايا العصبية وظيفة 7،12. وهكذا، فقد ثبت أن إضافة thrombospondin إلى خلايا الشبكية العقدة في المختبر أن تتجسد في تشكيل نقاط الاشتباك العصبي 13. ومع ذلك، ضرورية لجعل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية 13 عوامل أخرى غير معروفة بعد. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات الصادرة عن الخلايا النجمية يجب أن تحدد من أجل فهم أساس التفاعلات العصبية، الدبقية.
وقد وصفت زراعة الخلايا العصبية الابتدائية والخلايا النجمية من الماوس والفئران سابقا 14-16. نحن هناتقديم أداة أنيقة وتنوعا في الجمع بين أنواع الخلايا في نهج coculture غير مباشر. منذ الثقافتين يتم فصل جسديا بعد تقاسم نفس المتوسطة، وتأثير الخلايا العصبية، الخلايا النجمية والجزيئات القابلة للذوبان، ويمكن تحليلها على حدة، وبالتالي خلق أداة قوية لدراسات التفاعل بين الخلايا العصبية الدبقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف الرئيسي من البروتوكول الحالي هو الثقافات العصبية ونجمي منفصلة تماما، مع الحفاظ عليها في متوسطة المشتركة. لهذا السبب، ينبغي التحقق من نقاء الثقافات التي تم الحصول عليها في بداية الإجراء. نحن نوصي باستخدام تويولين الخلايا العصبية محددة، neurofilaments أو البروتين NeuN…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
Referências
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
