La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em> In Vitro</em> Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía
Summary
Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.
Abstract
el desarrollo neuronal y la función es el requisito previo del desarrollo como en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la formación altamente controlada y mantenimiento de redes neuronales complejas no se entienden por completo hasta el momento. Las preguntas abiertas relativas a las neuronas en salud y la enfermedad son diversas y que va desde la comprensión del desarrollo de base a la investigación de patologías relacionadas con el hombre, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia. El análisis más detallado de las neuronas se puede realizar in vitro. Sin embargo, las neuronas son células exigentes y necesitan el apoyo adicional de los astrocitos para su supervivencia a largo plazo. Esta heterogeneidad celular está en conflicto con el objetivo de diseccionar el análisis de las neuronas y astrocitos. Presentamos aquí un ensayo de cultivo celular que permite la co-cultivo a largo plazo de las neuronas y astrocitos primarios puros, que comparten el mismo medio químicamente definido, mientras que estar físicamenteapartado. En esta configuración, las culturas sobreviven durante un máximo de cuatro semanas y el ensayo es adecuado para una diversidad de investigaciones relativas a la interacción neurona-glía.
Introduction
A lo largo de las últimas décadas, la interpretación general de la función neuroglia ha evolucionado a partir de la atribución de un apoyo meramente hacia un papel regulador activo en relación con la función neuronal 1. Debido a su impacto importante en la homeostasis cerebral en salud y enfermedad 2, los astrocitos son de especial interés para la comunidad científica. En los últimos años, una diversidad de estudios se han centrado en las interacciones neurona-glía in vivo e in vitro 3. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de cultivo no permiten el análisis separado de los dos tipos de células y de sus respectivos secretomas.
Varios enfoques explotan el cocultivo directo de las neuronas y glía para lograr la supervivencia de larga duración y el desarrollo de la red neuronal fisiológicamente relevante 4-6. El presente protocolo alcanza los mismos objetivos, manteniendo ambos tipos de células separadas físicamente 7. En comparación con conditioned medio se aproxima a 8,9, nuestro sistema permite estudiar la comunicación bidireccional entre neuronas y astrocitos. La expresión de moléculas de señalización secretadas se puede monitorizar mientras que las células maduran en el medio compartido. Esta oportunidad es especialmente relevante, como astrocitos liberan factores solubles, tales como citoquinas, factores de crecimiento y moléculas de matriz extracelular 10,11, regulando de este modo el crecimiento neuronal y la función 7,12. Por lo tanto, se ha demostrado que la adición de trombospondina a las células ganglionares de la retina in vitro induce la formación de sinapsis 13. Sin embargo, otros factores desconocidos son necesarias para hacer sinapsis funcionales 13. Además, las moléculas liberadas por los astrocitos tienen que identificarse con el fin de comprender la base de las interacciones neurona-glía.
El cultivo de las neuronas primarias y astrocitos de ratón y de rata se ha descrito previamente 14-16. Aquí nosotrospresentar una herramienta elegante y versátil para combinar ambos tipos de células en un enfoque cocultivo indirecto. Dado que las dos culturas se separan físicamente aún compartiendo el mismo medio, el impacto de las neuronas, astrocitos y las moléculas solubles, pueden ser analizados por separado, creando así una poderosa herramienta para estudios de interacciones neurona-glía.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo principal del protocolo actual consiste en cultivos neuronales y los astrocitos completamente separados, mientras se mantiene en medio compartido. Por esta razón, la pureza de los cultivos obtenidos debe ser verificada en el comienzo del procedimiento. Se recomienda el uso de la tubulina específico de neuronas, o la proteína de neurofilamentos NeuN como marcadores neuronales, GFAP como marcador de los astrocitos, antígeno O4 como marcador precursor de oligodendrocitos y la proteína Iba1 para identificar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
Referências
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