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Chemistry

一个优化的协议通过使用金纳米粒子的放射性标记效率 Published: October 10, 2016 doi: 10.3791/54759
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 1,2, 1, 1,2
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

Summary

对于一个125 I标记的叠氮化物的合成和dibenzocyclooctyne（DBCO） -基共轭，13纳米大小的金使用无铜点击反应的纳米粒子的放射性标记的详细过程进行说明。

Protocol

注意：放射性碘的氧化形式是相当挥发性的，且必须有足够的铅屏蔽和铅的小瓶处理。所有放射化学步骤应在通风良好的木炭过滤通风橱中进行，实验程序需要通过放射性检测装置进行监控。

1.化学品和反向相萃取柱的制备125 I标记的叠氮合成

  1. 在溶液试剂的制备
    1. 溶解1毫克150微升叠氮化物前体（2）无水乙醇（ 图1）。
      注：叠氮化物前体的详细合成步骤（2）据报道，在以前的论文22。
    2. 在20μl1×磷酸盐缓冲盐水（pH = 7.4）的溶解1毫克的氯胺T。
    3. 溶解2毫克焦亚硫酸钠在20μlH 2 O
  2. Prepara墨盒化
    1. 用10ml无水乙醇，然后用10毫升水2 O洗tC18柱不干燥与空气筒的矩阵。

2. 125 I标记的叠氮化辅基的放射合成

  1. 前体的放射性碘化反应
    1. 添加叠氮化物前体溶液（1毫克150微升绝对乙醇）和乙酸（10微升）到1.5ml微量离心管中。
    2. 在0.1M的NaOH（50微升）添加的[125 I]碘化钠150活度到反应混合物中。
    3. 添加氯胺T溶液（1mg在20μl1×磷酸盐缓冲盐水），并关闭含有微量离心管反应混合物。
    4. 在室温下孵育该反应混合物15分钟，直到放射性碘化反应完成。
    5. 一个焦亚硫酸钠溶液（2毫克在20μlH 2 O）加入到该反应混合物以猝灭放射性碘化反应。
    6. 撤回0.2微升粗产物，然后用100微升的溶液稀释（H 2 O / CH 3 CN，1:1）进行HPLC分析。
      注：对于所有的HPLC实验中，使用含有H 2 O（溶剂A）0.1％甲酸和0.1％甲酸含酸乙腈（溶剂B）作为洗脱剂。
    7. 通过使用反相分析放射性HPLC（分析稀释粗产物C18反相柱;流速：1ml /分钟;洗脱剂梯度：0-2分钟，20％溶剂B，20-80％溶剂B为2-22分钟，为22-23分钟80-100％溶剂B，和100％溶剂B为23-28分钟;保留时间：16.4分钟）（ 图2）。
  2. 用制备HPLC纯化粗产物
    注意：提供围绕型HPLC份足够铅屏蔽诸如喷射器，柱，检测器，收集瓶，并在其中流出物被收集在容器。
    1. 第撤Ë整个反应混合物倒入HPLC小瓶。冲洗，用乙腈（0.5毫升）的反应管中，加入漂洗到相同的注射小瓶中。稀释用H 2 O（1毫升）中收集的溶液。
    2. 注入粗产物到制备放射性HPLC（C18反相柱;流速：10ml /分钟;洗脱剂梯度：20％溶剂B为0-2分钟，20-80％溶剂B为2-22分钟，为22-23分钟80-100％溶剂B，以及用于23-28分钟100％溶剂B）。
    3. 收集表示125 I标记的叠氮化物（1）的放射性峰（ 叔 R这些HPLC条件下是17.8-18.8分钟）中的玻璃试管（ 图2）。
    4. 测量使用根据制造商的协议的放射性剂量校准馏分的放射化学产率。
    5. 注入纯化产品上使用，用于确定产物的放射化学纯度的相同HPLC条件分析放射性HPLC。
  3. 固相萃取的产物
    1. 稀释含用40ml纯H 2 O所需的产物（1）的级分
    2. 添加稀释的溶液成预处理tC18柱。
    3. 用另外的15毫升水2 O洗盒
    4. 洗脱被困在盒用2毫升丙酮到由一铅屏蔽保护的10-ml玻璃管制瓶内的产品（1）。测量使用根据制造商的协议的放射性剂量校准洗脱产物的放射性。
      注：二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇也可用于从盒中的产品的溶出。放射性的约5-10％，通常粘附在盒中，而剩余的放射性标记的产物不能通过使用过量的有机溶剂完全洗脱。
    5. 蒸发用氮气或氩气的气流的丙酮。
    6. 化解重用DMSO（100-200微升）为下放射性标记步骤sidue。

3. DBCO群结合的金纳米粒子的合成

  1. 13纳米大小的金表面改性与DBCO含基的聚乙二醇纳米粒
    1. 制备钠-柠檬酸盐稳定的金纳米粒子（3）（平均粒度= 13纳米）根据先前的报告24。
    2. 添加吐温20（1毫米，1.5毫升）的水溶液的柠檬酸盐稳定的金纳米粒子（10纳米，15毫升）。摇上轨道摇床进行20分钟的溶液中。
    3. 添加DBCO含有基团的聚乙二醇硫醇（平均分子量= 5,000，100μM，1.5毫升）的水溶液。摇上轨道摇床2小时的溶液中。
  2. 所述DBCO团改性金纳米颗粒的纯化
    1. 净化DBCO团改性的金纳米粒子（4）</ STRONG>是通过连续离心（11400 XG，15分钟×3）。
    2. 倒出上清液并加入纯水金纳米颗粒粒料再悬浮。

4.通过无铜点击反应DBCO团改性金纳米粒子的放射性标记

  1. 使用125 I标记的叠氮化物125 I标记的金纳米颗粒的合成（1）
    1. 通过使用离心分离（11400 xg离心，15分钟）制备DBCO团改性金纳米颗粒的浓溶液，并调整金纳米颗粒的浓度为2μM。
    2. 添加在DMSO（5微升）的125 I标记的叠氮化物（1）的4.1活度的悬浮液金纳米粒子（4）（2μM，50微升）。
    3. 孵育在40℃下将所得反应混合物60分钟。
    4. 从粗产物撤回等分试样（0.2微升），并将其应用到二氧化硅 - 共ated薄层色谱（TLC）板。
    5. 开发使用乙酸乙酯作为流动相的TLC板上。
    6. 放置在无线电型TLC扫描器TLC板上并运行扫描器监视根据制造商的方案的放射性标记反应（ 图3）。
  2. 粗产物的纯化
    1. 净化含有125 I标记的金纳米颗粒（4）通过离心（11400 xg离心，15分钟），将反应混合物。
    2. 倒出上清液并加入纯水金纳米颗粒粒料再悬浮。
    3. 从纯化的产物撤回等分试样（0.2微升），并将其应用到一个二氧化硅包覆TLC板上。
    4. 开发使用乙酸乙酯作为流动相的TLC板上。
    5. 放置在无线电型TLC扫描器TLC板上并运行扫描器，以确定125 I标记勒的放射化学产率和放射化学纯度ð纳米颗粒（4）（ 图3）根据制造商的协议。

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Representative Results

所述stannylated前体（2）的放射性碘化反应进行了使用[125 I]碘化钠，乙酸，和氯胺T 150活度在室温下15分钟，以提供放射性标记的产物（1）。粗混合物的制备HPLC纯化后，用放射化学产率的75±10％（N = 8）中得到所需产物。分析性HPLC显示，125 I标记产物的放射化学纯度是99％以上（ 图2），和产品1所观察到的比放射性40.7活度/微摩尔。通过使用盒含有纯化产物的组分的固相萃取提供的1的丙酮溶液。使用氮气或氩气的气流中，该有机溶剂可以被蒸发，然后将残余物可以再次在DMSO或无水乙醇中溶解为下STE页。

对于聚乙二醇修饰的金纳米颗粒的125 I标记，通过在图1中所示的方法制备的DBCO团改性金纳米颗粒。聚乙二醇硫醇的过量（分子量5,000）与DBCO基是与反应柠檬酸，稳定13纳米的黄金纳米粒子。在改性步骤后，将产物通过连续离心纯化，得到DBCO官能金纳米颗粒（3）。在放射性标记步骤中，1 3.7活度加入到2微米的3（DBCO组〜400微米），和标记反应在40℃进行1小时进行。无线电TLC分析表明，1 95％以上，用该DBCO基团的官能化的金纳米粒子（3）在60分钟内进行反应。该反应进行60分钟，然后将粗产物PUR指明分数通过离心。125 I标记的金纳米颗粒（4）用> 99％（N = 4）的放射化学产率，为通过无线电TLC（ 图3）测定得到的。

图1
图1. 125 I标记的叠氮化物的放射合成（1）和125 I标记的金纳米颗粒（4）。试剂和条件：（a）[125 I]碘化钠，乙酸，氯胺T，室温，15分钟，75±10％（N = 8）的放射化学产率; （ 二 ）DBCO-PEG-SH（MW 5000），H 2 O，RT，2小时; 〜40°C，60分钟，> 99％，放化收益率。 请点击此处查看该图的放大版本。

T =“图2”SRC =“/文件/ ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg”/>
图2. 125 I标记的叠氮化物的分析性HPLC色谱图（1）。 （a）该粗产物Radiochromatogram。纯化的产物（b）的Radiochromatogram。纯化的产品（ 三 ）UV色谱（254纳米）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 125 I标记的金纳米颗粒的无线电型TLC 的结果（4）（4 = 0.05 的 R F，R 的F 1 = 0.45，洗脱剂：乙酸乙酯）（ 一 ）60分钟反应和（b）后纯化后。/ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

在一般情况下，纯化的125 I标记的叠氮化物（1）所观察到的放射化学产率为75±10％（N = 8）。放射性标记用放射性50-150活度完成，放射化学的结果是相当一致的。如果[125 I]碘化钠（T 1/2 = 59.4 D）将经历放射性衰变了一个多月的放射性碘化反应时，观察到1放化收益率将略有下降（53-65％）。因此，我们建议，因为它产生的[125 I]碘化钠尽快利用或递送到实验室，以便获得优化的放射化学产率。此外，新制备的氯胺T溶液也应在反应中使用，以获得所需的放射化学产率。

因为前体（2）是相当疏水的，150微升绝对乙醇应加以溶解1毫克的[125 I]碘化钠后浑浊。前体的溶解度下降往往导致1的低放射化学产量。 DMSO也可用于对放射性标记步骤中溶解2。此外，乙酸应该被添加到前体溶液中以获得在放射性碘化步骤高的放射化学产率。

使用制备性HPLC对含有1粗产物的纯化之前，在反相HPLC柱需要用溶剂A和B（流速洗涤：10ml /分钟;洗脱剂梯度：0-10分钟，100％溶剂B，100 -0％溶剂B为10-25分钟，和0％溶剂B为25〜30分钟），以从系统中除去的杂质微量。接着，反相HPLC柱用20％溶剂B在80％溶剂A平衡至少20分钟，得到的1的一致的保留时间。

含有纯化的1的部分应与4倍以上的固相萃取过程在H 2 O的体积稀释。否则，一些纯化的产物不能被困在tC18柱。当使用丙酮洗脱从盒纯化1，可以由丙酮的蒸发减少最终体积在环境温度下氮气或氩气的气流。

在几个放射性碘，125我被选中，并在目前的研究中使用。不同种类的碘的放射性同位素，需要使用本发明的方法在其它生物和医学研究进行测试（ 例如，124 I用于PET成像，131 I用于治疗目的）。

据我们了解，目前単协议是详细描述了syntheti第一次报告对于放射性碘标记的叠氮C组的步骤。最近，我们出版了另一叠氮辅基，具有不同的结构23。然而，放射性标记的叠氮化物（1）在当前的方法中与DBCO含有基团的分子放射性标记效率方面提供比其他稍好放射化学结果。现有的放射性碘标记辅基（ 即N-羟基马来酰亚胺）无法提供网站特异性。然而，本发明的方法证明具有优良的bioorthogonality沿直截了当放射性标记效率。由于叠氮化物官能团被称为是在生理条件和体内环境高度稳定，放射性标记的产物（1）可以在靶向预体内成像研究使用。我们预计，这种方法将被有效地应用于在体外和体内碘的放射性同位素拉包含应变cyclooctyne生物分子结构和纳米材料的乱棍。

基于1的比放射性，125 I和金纳米颗粒的计算的摩尔比为约1：1 125 I标记的金纳米颗粒（4）可在纳米材料的分子成像和生物分布研究中使用。当前的方法也可应用到不同大小和金的纳米材料的形状的放射性碘标记。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloramine T trihydrate Sigma 402869
[125I]NaI in aq. NaOH Perkin-Elmer NEZ033A010MC
Sodium metabisulfite  Sigma S9000
Formic acid Sigma 251364
Sep-Pak tC18 plus cartridge Waters WAT036800
Dimethyl sulfoxide  Sigma D2650
Acetone Sigma 650501
Ethanol Sigma 459844
Gold(III) chloride trihydrate Sigma 520918
Tween 20  Sigma P1379
DBCO PEG SH (MW 5,000) NANOCS PG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254 Merck
Analytical HPLC Agilent 1290 Infinity Model number
Preparative HPLC Agilent 1260 Infinity Model number
Analytical C18 reverse-phase column Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase column Agilent PrepHT XDB-C18
Radio TLC scanner Bioscan AR-2000 Model number
Radioisotope dose calibrator Capintec, Inc CRC -25R dose calibrator Model number

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References

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化学，第116，放射性标记，放射性同位素，放射性示踪剂，放射性碘，生物正交反应，无铜点击反应，辅基，叠氮化物，金纳米粒子
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