3D cuantitativa<em> In silico</em> Modelado (q3DISM) de beta-amiloide cerebral fagocitosis en roedores modelos de enfermedad de Alzheimer
Summary
Hemos desarrollado una metodología para 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) de β-amiloide cerebral fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ser generalizado para la cuantificación de virtualmente cualquier caso fagocítica in vivo.
Abstract
Neuroinflamación es ahora reconocida como un factor etiológico importante en la enfermedad neurodegenerativa. fagocitos mononucleares son células inmunes innatas responsables de la fagocitosis y la eliminación de escombros y detritus. Estas células incluyen macrófagos residentes del SNC conocidas como microglia y fagocitos mononucleares infiltrantes de la periferia. Microscopía de luz en general se ha utilizado para visualizar la fagocitosis en roedores o muestras de cerebro humano. Sin embargo, los métodos cualitativos no han proporcionado pruebas definitivas de la fagocitosis in vivo. A continuación, describimos 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM), un método robusto que permite la cuantificación verdadera 3D de amiloide-β fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA). El método implica la visualización de fluorescencia Aß encapsulado dentro fagolisosomas en secciones del cerebro de roedores. Grandes conjuntos de datos confocal z dimensiones son entonces reconstruidos en 3D para la cuantificación de A &# 946; espacialmente colocalized dentro del fagolisosoma. Se demuestra la aplicación exitosa de q3DISM de cerebros de ratones y ratas, pero esta metodología se puede extender a prácticamente cualquier evento de fagocitosis en cualquier tejido.
Introduction
La enfermedad de Alzheimer (EA), la demencia más común relacionada con la edad 1, se caracteriza por la acumulación de amiloide cerebral-β (Aß) en forma de placas "seniles" ß-amiloide, la neuroinflamación crónica de bajo nivel, taupatía, pérdida neuronal y alteraciones cognitivas 2 . En los cerebros de pacientes con AD, la neuroinflamación se destina por los astrocitos y los fagocitos mononucleares reactiva (referida como microglia, aunque sus centrales vs. origen periférico sigue siendo poco clara) que rodea los depósitos de Aß 3. Como los centinelas inmunes innatas del CNS, microglia se posicionan centralmente para borrar cerebro Aß. Sin embargo, el reclutamiento microglial a las placas de Aß se acompaña de muy poca, o ninguna, la fagocitosis Aß 4,5. Una hipótesis es que la microglía son inicialmente neuroprotector por phagocytozing pequeños montajes de Aß. Sin embargo, con el tiempo estas células se convierten neurotóxico tan abrumadora carga de Aß y / o relacionada con la edad d funcionalecline, provoca la microglía en un fenotipo proinflamatorio disfuncional, lo que contribuye a la neurotoxicidad y la disminución cognitiva 6.
Los estudios de asociación de genoma completo (GWAS recientes) han identificado un grupo de alelos de riesgo de AD que pertenecen al núcleo vías inmune innata que modulan la fagocitosis 7 8-11. En consecuencia, la respuesta inmune a la deposición de amiloide cerebral se ha convertido en una importante área de interés, tanto en términos de la comprensión de la etiología de AD y para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos 12-14. Sin embargo, hay una necesidad vital de la metodología para evaluar la fagocitosis Aß in vivo. Para hacer frente a esta necesidad no satisfecha, hemos desarrollado 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) para permitir la cuantificación real en 3D de la fagocitosis cerebral Aß por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer similar.
Limitada sólo por el grado en que recapitular la enfermedad, los modelos animales tienensido de gran ayuda para la comprensión de pathoetiology AD y para la evaluación terapéutica experimental. Debido al hecho de que las mutaciones en los genes presenilina (PS) y la proteína amiloide Precursor (APP) causan independientemente AD autosómica dominante, estos transgenes mutantes se han utilizado ampliamente para generar modelos de roedores transgénicos. Los ratones transgénicos APP / PS1 co-expresar de forma simultánea "sueca" APP mutante humana (SWE APP) y Δ exón 9 presenilina humana mutante 1 (PS1ΔE9) presentes con amiloidosis cerebral acelerada y la neuroinflamación 15,16. Además, hemos generado ratones bi-transgénico coinjected con APP SWE y construcciones PS1ΔE9 (línea TgF344-AD, sobre un fondo Fischer 344). A diferencia de modelos de ratones transgénicos de amiloidosis cerebral, ratas TgF344-AD desarrollan amiloide cerebral que precede taupatía, pérdida de apoptosis de las neuronas, y el deterioro del comportamiento 17.
En este informe, se describe un protocolo para la immunostaining microglia, fagolisosomas y depósitos de Aß en secciones cerebrales de ratones APP / PS1 y ratas TgF344-AD, y la adquisición de grandes imágenes confocal z-dimensional. Nos detalle pt la generación y análisis de las verdaderas reconstrucciones 3D a partir de conjuntos de datos confocal que permite la cuantificación de la captación de Aß en fagolisosomas microgliales silico. En términos más generales, la metodología que detallamos aquí se puede utilizar para cuantificar prácticamente cualquier forma de fagocitosis in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que se describe en este informe para una verdadera cuantificación 3D de Aß fagocitosis in vivo por los fagocitos mononucleares se basa en el etiquetado específico de los compartimentos celulares y subcelulares, así como los depósitos de Aß. Específicamente, usamos Iba1 (ionizada-calcio Encuadernación adaptador molécula 1), una proteína que está implicada en ruffling membrana y la fagocitosis tras la activación de células 18, 19, para teñir los fagocito…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Materials
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |
Referências
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