פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.
Neuroinflammation מוכרת כיום כגורם אטיולוגי מרכזי למחלות ניווניות. פגוציטים mononuclear הם תאי מולד חיסוניים אחראים phagocytosis ופינוי פסול שאריות. תאים אלה כוללים מקרופאגים CNS-תושב המכונה microglia, ואת phagocytes mononuclear שחדר מהפריפריה. במיקרוסקופ אור כבר משמש בדרך כלל כדי לחזות phagocytosis ב מכרסמים או דגימות מוח אנושי. עם זאת, שיטות איכותיות לא ספקו ראיות מוחלטות של in vivo phagocytosis. כאן אנו מתארים 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM), שיטה חזקה המאפשרת לכמת 3D אמיתי של עמילואיד-β (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במחלת מכרסם אלצהיימר (AD) מודלים. השיטה כרוכה fluorescently חזותי Aβ כמוסה בתוך phagolysosomes בסעיפי מוח מכרסם. מערכי נתונים confocal z-ממדי גדולים אז 3D המשוחזר כדי לכמת את A &# 946; מרחבית colocalized בתוך phagolysosome. אנו מדגימים את היישום המוצלח של q3DISM כדי מוח עכבר וחולדה, אבל מתודולוגיה זו ניתן להרחיב כמעט כל אירוע phagocytic בכל רקמה.
מחלת אלצהיימר (AD), דמנציה 1 הקשורה הגיל הנפוץ ביותר, מאופיין עמילואיד-β מוחין (Aβ) הצטברות כמו "סנילי" הפלאק β עמילואיד, neuroinflammation ברמה נמוכה כרונית, tauopathy, איבוד עצבי, והפרעה קוגניטיבית 2 . במוחות המטופל לספירה, neuroinflammation מיועד ידי תגובתי אסטרוציטים פגוציטים mononuclear (המכונה microglia, למרות המרכזי שלהם לעומת ממוצא הפריפריה עדיין לא ברור) שמסביב Aβ פיקדונות 3. כמו זקיפים החיסון המולדת של מערכת העצבים המרכזית, microglia ממוקמים מרכזי להצליל Aβ. עם זאת, גיוס microglial הפלאק Aβ מלווה מעט מאוד, אם בכלל, Aβ phagocytosis 4,5. אחת ההשערות היא כי microglia הם בתחילה נוירו ידי phagocytozing מכלולים קטנים של Aβ. עם זאת, בסופו של דבר תאים אלה הופכים הנוירו כמו נטל Aβ המכריע ו / או ד תפקודית כתוצאה מהזדקנותecline, מעורר microglia לתוך פנוטיפ מעודד דלקת מתפקדת, תורם לירידה ברעילות וקוגניטיביות 6.
הגנום כולו אחרונים מחקרים אגודים (GWAS) זיהו מקבץ של אללים לסיכון לחלות באלצהיימר השייכים מסלולי חיסון מולדים ליבת 7 לווסת phagocytosis 8-11. כתוצאה מכך, התגובה החיסונית בתצהיר עמילואיד מוחין הפך אזור מרכזי של עניין, הן מבחינת הבנת האטיולוגיה לספירה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות 12-14. עם זאת, יש צורך חיוני מתודולוגיה להערכת phagocytosis Aβ in vivo. כדי לתת מענה לצורך מסופקים זה, פיתחנו 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) כדי לאפשר quantitation 3D אמיתי של phagocytosis Aβ מוחין ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר דמוי.
מוגבל רק על ידי המידה שבה הם לשחזר מחלה, במודלים של בעלי החיים ישהוכח שלא יסולא בפז להבנה לספירה pathoetiology ולהערכה רפוי ניסיון. בשל העובדה כי מוטציות בגנים presenilin (PS) ו חלבון מקדים עמילואיד (APP) עצמאי לגרום לספירה אוטוזומלית דומיננטית, transgenes מוטציה אלה נעשה שימוש נרחב כדי ליצור מודלים מכרסם מהונדס. מהונדס APP / PS1 עכברים coexpressing זמנית "שוודית" APP האנושי מוטציה (swe APP) ו Δ אקסון 9 presenilin 1 אדם מוטציה (PS1ΔE9) הנוכחי עם עמילואידוזיס מוחין מואץ neuroinflammation 15,16. יתר על כן, יצרנו חולדות דו-מהונדס coinjected עם APP swe ובונה PS1ΔE9 (קו TgF344-AD, על רקע פישר 344). בניגוד למודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס מוחין, חולדות TgF344-AD לפתח עמילואיד מוחין שמקדים tauopathy, אובדן אפופטוטיים של נוירונים, ו ליקוי התנהגותי 17.
בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור IMMunostaining microglia, phagolysosomes ופיקדונות Aβ בסעיפי מוח מעכברי APP / PS1 וחולדות TgF344-AD, ורכישת תמונות confocal z-ממדי גדולות. נפרטנו בדור סיליקון וניתוח של שחזורי 3D אמיתיים ממערכות נתוני confocal המאפשרים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes microglial. באופן כללי יותר, מתודולוגיה נפרט כאן ניתן להשתמש כדי לכמת כמעט כל צורה של phagocytosis in vivo.
הפרוטוקול זה אנו מתארים בדוח זה כדי לכמת 3D אמיתי של phagocytosis Aβ in vivo על ידי פגוציטים mononuclear מסתמך על תיוג ספציפי של תאים סלולריים ו subcellular וכן פיקדונות Aβ. באופן ספציפי, אנו משתמשים Iba1 (מיונן בסידן כריכה מתאם המולקולה 1), חלבון כי הוא מעורב עלעול קרום phagocytosis על תא הפעלה …
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |