プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール
Summary
この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。
Abstract
透過型電子顕微鏡（TEM）は、タンパク質を局在化し、非常に高い分解能で高分子複合体を可視化するために、細胞の超微細構造を研究するための特別なツールです。しかし、本来の状態にできるだけ近い取得するには、完璧なサンプル保存が必要です。従来の電子顕微鏡（EM）アルデヒド固定、例えば、良好な超微細構造保存を提供しません。固定剤の遅い浸透は、様々な細胞成分の細胞の再編成および損失を誘発します。したがって、従来のEM固定は、構造および抗原性の瞬間的安定化および保存を可能にしません。細胞内事象を調べるための最良の選択は、その天然の状態で細胞を維持し、凍結置換固定法に続いて低温固定を使用することです。高圧凍結細胞の超微細構造の整合性を維持する/凍結置換は、最も一般的に使用される方法ですが、expensiが必要です機器VEの。ここでは、懸濁細胞培養のための凍結置換に続いて、使いやすく、低コストの凍結固定方法が提示されます。
Introduction
サンプル調製は、電子顕微鏡検査の成功のために重要です。従来のEM固定は、透過型電子顕微鏡（TEM） 1の組織または細胞を固定するための主要な方法であった1 。まず、アルデヒドと四酸化オスミウムを用いて室温で材料を化学的に固定する。次いで、材料を有機溶媒で脱水し、浸透させ、エポキシ樹脂に包埋する。この方法は、細胞への固定剤の浸透率に依存する。結果として、アーチファクトおよび細胞内容物の抽出が通常観察される2 。
凍結融解は、明らかに、細胞構造3の保存のためのより良い選択肢であり、それらをそのまま維持する。薄い樹脂切片における最高品質のTEM画像4は、低温固定/凍結置換法を用いて得ることができる。この技術の目的は、ガラス化されたbiologicalサンプル氷晶形成せず、または細胞の超微細構造を損傷しない十分に小さな氷晶を含みます。 （HPF）を凍結高圧またプランジ凍結（PF）と呼ばれる超急速低温固定は、サンプルをcryofixするための2つの方法です。 HPFは瞬間セル内の分子を固定化し、従来のEM固定によって引き起こされる損傷を回避します。冷凍機や自動置換デバイスのいくつかのタイプが5を開発されています。冷凍機や消耗品（液体窒素等のキャリアを試料）は高価であり、それらは、高品質の電子顕微鏡写真6,7の製造を可能にします。 PFは、1950年代初期に使用された技術であり、PF手順を.During簡単で安価な8として文献に記載され、調製された試料は、氷の結晶が5nm未満3サイズ得るために急速に凍結されます。この目的を達成するために、サンプルがありますエタン、プロパン、エタンまたはプロパンの混合物として、液体寒剤に突入。 1950年代以来、PFの改善は、より多くのユーザーにこの技術を利用できるようにするために行われてきました。 PFは広く画像小さな物体（<100 nmのに使用されるのに対し、高圧凍結は、現在、50ミクロン（ディスク状サンプルについて200μmの厚さまで）5よりも厚い試料の多種多様を凍結するための唯一の実行可能な方法であります）、アモルファス氷9の薄膜に懸濁高分子複合体など。より大きなサンプルは、例えば、真核細胞は、PFによってcryofixedすることができるが、そのようなキャピラリー銅管またはサンドイッチシステム8、10、11のように、試料ホルダーを必要とします。
ここでは、迅速で簡単に使用し、様々な懸濁細胞培養のために使用可能な低コストのプランジ凍結/凍結置換技術が提示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
TEMは、細胞小器官、細胞、および組織の微細構造観察するための強力な方法です。低温固定/凍結置換は現在、超微細構造とタンパク質の抗原性の両方の保全のための最善の方法です。化学固定剤は、超微細2の完全な安定化の前に構造的再編成を許可することにより、非常にゆっくりと浸透し、行動します。逆に、低温固定/凍結置換は瞬時に細胞構造4を?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿上の彼らの助けとコメントのためにM. Bouchecareilh、E.Tétaud、S. Duvezin-Caubet、およびA.デヴィンへの感謝の意を表明します。私たちは、画像が撮影されたボルドーイメージングセンターの電子撮像ポールに感謝しています。この作品は、センター国立デラRECHERCHE科学研究によってサポートされていました。
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Referências
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