Plunge congelamento: uno strumento per l'ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione
Summary
Questo manoscritto descrive un metodo facile da usare e cryofixation basso costo per la visualizzazione cellule in sospensione mediante microscopia elettronica a trasmissione.
Abstract
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è uno straordinario strumento per studiare ultrastruttura delle cellule, al fine di localizzare le proteine e visualizzare complessi macromolecolari ad altissima risoluzione. Tuttavia, per ottenere il più vicino possibile allo stato nativo, è necessaria la conservazione del campione perfetto. Convenzionale microscopia elettronica (EM) fissazione con aldeidi, per esempio, non fornisce una buona conservazione ultrastrutturali. La lenta penetrazione di fissativi induce riorganizzazione cellulare e la perdita di vari componenti cellulari. Pertanto, convenzionale fissazione EM non consente una stabilizzazione istantanea e preservare le strutture e antigenicità. La scelta migliore per l'esame di eventi intracellulari è utilizzare cryofixation seguito dal metodo di fissaggio freeze-sostituzione che mantiene le cellule nel loro stato nativo. Alta pressione congelamento / freeze-sostituzione, che preserva l'integrità della ultrastruttura cellulare, è il metodo più comunemente utilizzato, ma richiede expensive attrezzature. Qui, un metodo facile da usare ed economici freeze fissazione seguita da congelamento-sostituzione per colture cellulari La sospensione viene presentato.
Introduction
La preparazione del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi studio di microscopia elettronica. Convenzionale fissazione EM era il metodo primario per fissare tessuti o cellule per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 1. In primo luogo, aldeidi e osmio tetrossido sono utilizzati per fissare chimicamente il materiale a temperatura ambiente. Poi, il materiale viene disidratato con solventi organici, infiltrato, e incorporata in resina epossidica. Questo metodo dipende dal tasso di penetrazione del fissativi nella cellula. Di conseguenza, i manufatti ed estrazione dei contenuti cellulari sono generalmente osservati 2.
Cryofixation è chiaramente un'alternativa migliore per la conservazione di strutture cellulari 3, mantenendo intatte. La più alta qualità delle immagini TEM 4 in sezioni sottili di resina può essere ottenuta utilizzando il metodo di sostituzione cryofixation / congelamento. Lo scopo di questa tecnica è quello di ottenere bi vetrificatocampioni ological senza formazione di cristalli di ghiaccio o di cristalli di ghiaccio contenenti abbastanza piccolo da non danneggiare l'ultrastruttura delle cellule. Ad alta pressione di congelamento (HPF) e ultrarapido cryofixation, che è anche chiamato tuffo congelamento (PF), sono due metodi per cryofix campioni. HPF immobilizza molecole nella cellula istantaneamente ed evita danni causati dal convenzionale fissazione EM. Diversi tipi di macchine di congelamento e dispositivi automatici di sostituzione sono stati sviluppati 5. Le macchine e di consumo di congelamento (azoto liquido, dei campioni vettori, ecc) sono costosi, ma consentono di produrre micrografie elettroniche di alta qualità 6, 7. PF è una tecnica che è stata utilizzata nei primi anni 1950 ed è descritto in letteratura come semplice ed economico 8 .Durante la procedura PF, il campione preparato è congelato a un ritmo rapido per ottenere cristalli di ghiaccio dimensione inferiore 3 a 5 nm. A tal fine, il campione èImmerso in un criogenico liquido, come ad esempio etano, propano o una miscela di etano-propano. Fin dagli anni '50 sono stati apportati miglioramenti di PF per rendere disponibile questa tecnica ad un maggior numero di utenti. Il congelamento ad alta pressione è attualmente l'unico modo efficace per congelare una grande varietà di campioni di spessore superiore a 50 μm (fino a uno spessore di 200 μm per i campioni a forma di disco) 5 , mentre PF è ampiamente usato per rappresentare piccoli oggetti (<100 nm ), Come i complessi macromolecolari sospesi in un film sottile di ghiaccio amorfo 9 . Campioni più grandi, ad esempio le cellule eucariotiche, possono essere criosidite da PF, ma necessitano di detti campioni, come i tubi di rame capillari oi sistemi a sandwich 8 , 10 , 11 .
Qui viene presentata una tecnologia veloce, facile da usare e a basso costo di congelamento / congelamento a tuffo utilizzabile per diverse colture di cellule di sospensione.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM è un metodo efficace per l'osservazione ultrastrutturale di organelli, cellule e tessuti. Cryofixation / freeze-sostituzione è attualmente il metodo migliore per la conservazione di entrambi ultrastruttura e proteine antigenicità. Fissativi chimici penetrano e si comportano molto lentamente consentendo in tal modo riarrangiamenti strutturali prima della completa stabilizzazione della ultrastruttura 2. Al contrario, cryofixation / freeze-sostituzione stabilizza immediatamente stru…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esprimiamo la nostra gratitudine a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, e A. Devin per il loro aiuto e commenti sul manoscritto. Siamo grati al polo di imaging elettronico di Bordeaux Imaging Center, dove sono state scattate le immagini. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Referências
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