La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Summary

Este manuscrito describe un método fácil de usar y criofijación bajo costo para la visualización de células en suspensión por microscopía electrónica de transmisión.

Abstract

Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) es una herramienta extraordinaria para estudiar la ultraestructura celular, con el fin de localizar las proteínas y visualizar complejos macromoleculares a muy alta resolución. Sin embargo, para llegar lo más cerca posible al estado nativo, es necesaria conservación de la muestra perfecta. la fijación convencional microscopía electrónica (EM) con aldehídos, por ejemplo, no proporciona una buena conservación ultraestructural. La penetración lenta de fijadores induce reorganización celular y la pérdida de los diversos componentes de la célula. Por lo tanto, la fijación EM convencional no permite una estabilización instantánea y la preservación de las estructuras y antigenicidad. La mejor opción para el examen de eventos intracelulares es utilizar criofijación seguido por el método de fijación de congelación-sustitución que mantiene a las células en su estado nativo. congelación de alta presión / de congelación-sustitución, que conserva la integridad de la ultraestructura celular, es el método más comúnmente utilizado, pero requiere expensicinco equipos. Aquí, se presenta un método fácil de usar y fijación de congelación bajo costo seguido de congelación-sustitución de cultivos de células en suspensión.

Introduction

Preparación de la muestra es crítico para el éxito de cualquier estudio de microscopía electrónica. Convencional fijación EM era el principal método para la fijación de tejidos o células para microscopía electrónica de transmisión (TEM) ^1. En primer lugar, aldehídos y tetróxido de osmio se utilizan para fijar químicamente el material a temperatura ambiente. Luego, el material se deshidrató con disolventes orgánicos, se infiltró, y se embebió en resina epoxi. Este método depende de la tasa de penetración de los fijadores en la célula. En consecuencia, los artefactos y la extracción de los contenidos celulares se observan generalmente ^2.

Criofijación es claramente una mejor alternativa para la preservación de las estructuras celulares ^3, manteniéndolos intactos. La más alta calidad de las imágenes de TEM ⁴ en las secciones de resina delgada se puede obtener usando el método de sustitución criofijación / congelación. El objetivo de esta técnica es obtener bi vitrificadomuestras ological sin formación de cristales de hielo o que contienen cristales de hielo lo suficientemente pequeñas como para no dañar la ultraestructura de las células. congelación de alta presión (HPF) y criofijación ultra-rápido, que también se llama paso de congelación (PF), dos métodos para cryofix muestras. HPF inmoviliza moléculas en la célula de forma instantánea y evita el daño causado por la fijación EM convencional. Existen varios tipos de máquinas de congelación y dispositivos de sustitución automáticos se han desarrollado ^5. Las máquinas de congelación y consumibles (nitrógeno líquido, la muestra de los transportistas, etc.) son caros, pero que permiten para la producción de micrografías electrónicas de alta calidad ^{6, 7.} PF es una técnica que se utilizó en la década de 1950 y que se describe en la literatura como simple y barato ⁸ .Durante el procedimiento de PF, la muestra preparada se congela a un ritmo rápido para obtener cristales de hielo tamaño de menos de 3 a 5 nm. Con este fin, la muestra essumergido en un criógeno líquido, tal como etano, propano, o una mezcla de etano-propano. Desde la década de 1950, las mejoras de PF se han hecho para hacer esta técnica a disposición de un mayor número de usuarios. Congelación de alta presión es actualmente la única forma viable para congelar una gran variedad de muestras más gruesa que 50 m (hasta un espesor de 200 micras para muestras en forma de disco) ^5, mientras que PF es ampliamente utilizado para la imagen objetos pequeños (<100 nm ), tales como complejos macromoleculares suspendidas en una película fina de hielo amorfo ^9. Muestras grandes, por ejemplo las células eucariotas, se pueden cryofixed por PF, pero requiere soportes para muestras, tales como tubos de cobre capilar o sistemas de sándwich ^{8, 10, 11.}

Aquí, una rápida, fácil de usar y de inmersión tecnología de congelación / congelación-sustitución bajo costo utilizable para diferentes cultivos de células de suspensión se presenta.

Protocol

1. Preparación de Formvar cuadrícula Film NOTA: Realizar la manipulación cloroformo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas). Utilice 400 rejillas de cobre de malla de microscopía electrónica. Con otros tipos de rejilla (otros tamaños de malla, de oro y de rejillas de níquel), la calidad de congelación es peor. Preparar una solución de 100 ml de 0,3% formvar en cloroformo. Deje que se disuelva durante l…

Representative Results

En este artículo, se presenta un método de congelación-fácil de usar y de inmersión de bajo costo para ultraestructurales (Figuras 1 y Figura 2) y immunolabeling (Figura 3) estudios. Se demuestra que no es necesario contar con un equipo especial para el procedimiento de congelación-sustitución y que el procedimiento de calentamiento tarda menos de 6 h en lugar de las 24 h utilizando un sistem…

Discussion

TEM es un método poderoso para la observación ultraestructural de los orgánulos, células y tejidos. Criofijación / congelación-sustitución es actualmente el mejor método para la conservación de ambos ultraestructura y la proteína de la antigenicidad. Fijadores químicos penetran y actúan muy lentamente permitiendo de este modo reordenamientos estructurales antes de la estabilización completa de la ultraestructura ^2. A la inversa, criofijación / congelación-sustitución estabiliza in…

Materials

Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8,5 ml	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia Coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11