Plunge Frysning: ett verktyg för Ultra och immunlokalisering Studier av suspensionsceller i transmissionselektronmikroskopi
Summary
Detta manuskript beskriver en enkel att använda och billig cryofixation metod för visualisering av suspensionsceller genom transmissionselektronmikroskopi.
Abstract
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är en extraordinär verktyg för att studera cellultrastruktur, för att lokalisera proteiner och visualisera makromolekylära komplex med mycket hög upplösning. Men för att komma så nära som möjligt till det nativa tillståndet är perfekt prov bevarande krävs. Konventionell elektronmikroskopi (EM) fixering med aldehyder, till exempel, inte ger bra ultrastrukturell konservering. Den långsamma penetreringen av fixativ inducerar cell omorganisation och förlust av olika cellkomponenter. Därför behöver konventionella EM fixering inte tillåta en momentan stabilisering och bevarande av strukturer och antigenicitet. Det bästa valet för att undersöka intracellulära händelser är att använda cryofixation följt av frys substitution fixeringsmetod som håller cellerna i sitt naturliga tillstånd. Högtrycks frysning / fryssubstitution, som bevarar integriteten för cellulära ultrastrukturen, är den vanligaste metoden, men kräver expensive utrustning. Här, är en enkel att använda och billig frysfixeringsmetod följt av frys-substitution för upphängning cellodlingar presenteras.
Introduction
Provberedning är avgörande för framgång för varje elektronmikroskopi studie. Konventionell EM fixering var den primära metoden för att fixera vävnad eller celler för transmissionselektronmikroskopi (TEM) 1. Först, är aldehyder och osmiumtetroxid användas för att kemiskt fixera materialet vid rumstemperatur. Sedan är materialet dehydratiseras med organiska lösningsmedel, infiltrerad, och inbäddades i epoxiharts. Denna metod är beroende av penetrationshastigheten för fixativ in i cellen. Följaktligen är de artefakter och extraktion av cellulära innehåll observeras vanligtvis 2.
Cryofixation är helt klart ett bättre alternativ för att bevara cellstrukturer 3, hålla dem intakta. Högsta kvalitet på TEM-bilder 4 i tunna hartssektioner kan erhållas med användning av cryofixation / fryssubstitutionsmetoden. Syftet med denna teknik är att få förglasat bimiologiska prover utan iskristaller bildning eller innehållande iskristaller små nog att inte skada ultrastruktur av cellerna. Högtrycksfrysning (HPF) och ultra-snabb cryofixation, som också kallas plunge frysning (PF), finns två metoder för att cryofix prover. HPF immobiliserar molekyler i cellen momentant och undviker skador orsakade av konventionell EM fixering. Flera typer av frysmaskiner och automatiska anordningar substitutions har utvecklats 5. Frysningsmaskiner och förbrukningsartiklar (flytande kväve, provbärare, etc.) är dyra, men de möjliggör framställning av högkvalitativa elektronmikrofotografier 6, 7. PF är en teknik som användes i början av 1950-talet och beskrivs i litteraturen som enkel och billig 8 .Under PF förfarandet, är det beredda provet frystes i snabb takt för att erhålla iskristaller storlek mindre än 3 och 5 nm. För detta ändamål är provplunged in i en flytande kryogen, såsom etan, propån, eller en etan-propanblandning. Sedan 1950-talet, har förbättringar av PF gjorts för att göra denna teknik tillgänglig för ett större antal användare. Högtrycks frysning är för närvarande det enda möjliga sättet att frysa en stor variation av prover tjockare än 50 pm (upp till en tjocklek av 200 | im för skivformade prover) 5, medan PF används ofta för att avbilda små föremål (<100 nm ), såsom makromolekylära komplex suspenderade i en tunn film av amorf is 9. Större prover, t ex eukaryota celler, kan cryofixed av PF, men kräver provhållare, såsom kapillär kopparrör eller sandwichsystem 8, 10, 11.
Här, en snabb, enkel att använda och billig dopp frysning / fryssubstitution teknik som kan användas för olika upphängningscellodlingar presenteras.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM är en kraftfull metod för ultrastrukturella observation av organeller, celler och vävnader. Cryofixation / fryssubstitution är för närvarande den bästa metoden för konservering av både ultrastruktur och protein antigenicitet. Kemiska fixativ penetrera och agera mycket långsamt därigenom tillåta strukturella omlagringar före fullständig stabilisering av ultrastrukturen 2. Omvänt, cryofixation / fryssubstitution stabiliserar omedelbart cellulära strukturer 4.</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrycker vår tacksamhet till M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet och A. Devin för deras hjälp och synpunkter på manuskriptet. Vi är tacksamma för den elektroniska bild pol Bordeaux Imaging Center där bilderna togs. Detta arbete stöddes av Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Referências
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
