2D و 3D مصفوفات لدراسة إنفادوسوم الخطي تشكيل والنشاط
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد مصفوفة مختلطة 2D، تتكون من الجيلاتين والكولاجين الأول، وكولاجين 3D أنا سد لدراسة إنفادوسوم الخطي. هذه البروتوكولات تسمح لدراسة تشكيل إنفادوزوم الخطي، نشاط تدهور مصفوفة، وقدرات الغزو من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا السرطانية.
Abstract
وتشارك التصاق الخلايا، والهجرة، والغزو في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. على سبيل المثال، أثناء تشكيل ورم خبيث، الخلايا السرطانية يجب أن عبور الحواجز التشريحية لغزو والهجرة من خلال الأنسجة المحيطة بها من أجل الوصول إلى الدم أو الأوعية اللمفاوية. وهذا يتطلب التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (إسم). على المستوى الخلوي، العديد من الخلايا، بما في ذلك غالبية الخلايا السرطانية، هي قادرة على تشكيل إنفادوسوميس، وهي الهياكل القائمة على أكتين F قادرة على تدهور إسم. إنفادوسوم هي هياكل أكتين بارزة التي تجنيد وتنشيط مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (مبس). التركيب الجزيئي، والكثافة، والتنظيم، وصلابة من إسم هي حاسمة في تنظيم تشكيل إنفادوسوم وتنشيط. في المختبر ، مقايسة الجيلاتين هو مقايسة القياسية المستخدمة لمراقبة وكمية النشاط إنفادوسوم تدهور. ومع ذلك، الجيلاتين، وهو الكولاجين التشويه والتحريف أنا، ليست مصفوفة الفسيولوجية هlement. تم تطوير مقايسة رواية باستخدام الألياف I نوع الكولاجين وتستخدم لإثبات أن هذه المصفوفة الفسيولوجية هو محفز قوي من إنفادوسوميس. إنفادوسومات التي تشكل على طول ألياف الكولاجين تعرف باسم إنفادوسوم الخطي بسبب تنظيمها الخطي على الألياف. وعلاوة على ذلك، أظهر التحليل الجزيئي من إنفادوسوم الخطي أن مستقبلات ديسيدين المجال 1 (DDR1) هو مستقبلات تشارك في تشكيلها. هذه البيانات تظهر بوضوح أهمية استخدام مصفوفة ذات صلة فسيولوجيا من أجل فهم التفاعلات المعقدة بين الخلايا و إسم.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (إسم) إعادة عرض يحدث خلال العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل الأوعية الدموية وغزو الخلايا السرطانية. في الحالات الفسيولوجية، وأنواع كثيرة من الخلايا، ومعظمهم من الأنساب المكونة للدم، قادرون على تحلل عناصر إسم. على سبيل المثال، الضامة قادرة على عبور الحواجز التشريحية للوصول إلى الأنسجة، والخلايا تتحلل مصفوفة العظام لضمان التوازن الكالسيوم. أكثر عالميا، جميع المصفوفات في الجسم تجديد للحفاظ على الخصائص الفيزيائية والكيميائية. في أنسجة السرطان، يتم تغيير تكوين المكروية الورم. على سبيل المثال، في سرطان الثدي والرئة، نوع I الكولاجين هو أوفيركسريسد ويتراكم حول الورم. وعلاوة على ذلك، ويرتبط هذا تراكم مع زيادة خطر الإصابة الانبثاث 1 ، 2 . السرطان الانبثاث يعتمد على قدرة الخلايا السرطانية على تحلل إسم والغزو الأنسجة المجاورة.
الينسب النشاط الغازية للخلايا إلى الهياكل الغنية أكتين المتخصصة المعروفة باسم إنفادوسوميس. هذا المصطلح يشمل بودوسوميس و إنفادوبوديا، التي توجد على التوالي، في الخلايا العادية والسرطانية (على سبيل المثال، الضامة، الخلايا البطانية، والخلايا السرطانية مثل مدا-مب-231 سرطان الثدي خط الخلايا). في المختبر ، إنفادوسوم يمكن تنظيمها في أشكال مختلفة: النقاط، المجاميع، أو وريدات 3 . بشكل كلاسيكي، إنفادوسوم تتكون من F- أكتين الأساسية التي تحتوي على العديد من البروتينات، مثل بروتين سقالة Tks5 والكورتاكتين، وتحيط بها جزيئات اللصق التصاق، مثل إنتغرينز والفينكولين 4 . في الآونة الأخيرة، تبين أن Tks5 و روغتباس Cdc42 يمكن أن تستخدم كحد أدنى التوقيع الجزيئي ل إنفادوسوميس وظيفية 5 . هذه الهياكل هي قادرة على تحلل إسم عن طريق توظيف وتفعيل البروتينات ميتالوبروتيس محددة، مثل MT1-مب و مب-2 6. في دراسة سابقة، ذكرنا أن التفاعل بين ألياف الكولاجين من النوع الأول ومستقبل المجال ديسكويدين 1 (DDR1)، مستقبلات محددة من ألياف الكولاجين من النوع الأول، يؤدي إلى تشكيل فئة جديدة من إنفادوسوميس، يدعى إنفادوسوم الخطي. يتم تشكيل إنفادوسوم الخطي على طول نوع I الألياف الكولاجين 7 . هذه الهياكل هي قادرة على تحلل نوع I الألياف الكولاجين عن طريق التوظيف وتفعيل MT1-مب / MMP2. وعلاوة على ذلك، وتشكيلها يعتمد على Tks5 و Cdc42 5 . في المختبر ، أثبتنا وجود إنفادوسوم الخطي وإشراك DDR1 في تشكيلها والنشاط 8 باستخدام استراتيجيات مختلفة تتكون من مزيج من مختلف عناصر المصفوفة، بما في ذلك: ط) كوفرسليبس المغلفة بالجيلاتين الفلورسنت، إي) نوع الفلورسنت أنا الكولاجين الليفي كوفرسليبس -cated، و 3) 3D نوع I المقابس الكولاجين. نظرا لاستخدام مصفوفات مختلفة، كنا قادرين على دراسة والطابعإيز تشكيل إنفادوزوم الخطي ونشاط تدهورها 7 ، 8 .
وأخيرا، لفهم أفضل لبيولوجيا الخلايا الغازية، تم استخدام مزيج من مكونات إسم في كل من أنظمة الثقافة 2D و 3D، محاكاة تعقيد تكوين المكروية الورم. وفيما يلي بروتوكولات لطلاء كوفرسليبس مع الجيلاتين / نوع I الكولاجين في 2D و 3D نظم الثقافة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل كلاسيكي، يتم دراسة إنفادوسوم في المختبر دون النظر إلى المكروية والمصفوفة التي يتم مطلي الخلايا. وتستخدم حاليا عدة أنواع من المصفوفات، بما في ذلك الجيلاتين، فبرونيكتين، فيترونكتين، أو عالية الكثافة الكولاجين فيبريلار (هدفك) 7 ، <sup class="xref"…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت جدم زمالة الدكتوراه من إنزيرم / ريجيون أكيتين وتدعم الآن من قبل زمالة أرك ما بعد الدكتوراه ومعهد تيش للسرطان في كلية جبل سيناء للطب. ويدعم إه درجة الدكتوراه من وزارة التعليم العالي والبحث العلمي. ويدعم زي من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من الوكالة الوطنية للبحث العلمي (أنر). ويدعم سم من قبل معهد تيش للسرطان في مدرسة جبل سيناء الطب ويدعم جي بي سي من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نسي منحة K22CA196750، وجزيرة طوكيو صندوق أبحاث السرطان العلماء صندوق جر، ومعهد السرطان تيشش في كلية جبل سيناء الطب. وأيد هذا العمل من منحة من أنر-13-جيك-JSV1-0005. فس يدعمه "ليغ ناتيونال كونتر لي كانسر." يتم دعم فم و فس بتمويل من "إكيب لابليسي ليغ ناتيونال كونتر لي كانسر 2016" و إنستيتوت ناتيونال دو كانسر، INCA_8036، و PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
Referências
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
