Matrices 2D et 3D pour étudier la formation et l'activité invadosome linéaire
Summary
Ce protocole décrit comment préparer une matrice mixte 2D, constituée de gélatine et de collagène I, et une prise de collagène I 3D pour étudier les invadosomes linéaires. Ces protocoles permettent l'étude de la formation linéaire d'invadosome, l'activité de dégradation matricielle et les capacités d'invasion des cellules primaires et des lignées cellulaires cancéreuses.
Abstract
L'adhésion, la migration et l'invasion cellulaire sont impliquées dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Par exemple, lors de la formation de métastases, les cellules tumorales doivent traverser les barrières anatomiques pour envahir et migrer à travers le tissu environnant afin d'atteindre le sang ou les vaisseaux lymphatiques. Cela nécessite l'interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM). Au niveau cellulaire, de nombreuses cellules, y compris la majorité des cellules cancéreuses, sont capables de former des invadosomes, qui sont des structures à base de F-actine capables de dégrader l'ECM. Les invadosomes sont des structures d'actine protrusives qui recrutent et activent des métalloprotéinases matricielles (MMP). La composition moléculaire, la densité, l'organisation et la rigidité de l'ECM sont essentielles pour réguler la formation et l'activation de l'invadosome. In vitro , un dosage de gélatine est l'essai standard utilisé pour observer et quantifier l'activité de dégradation de l'invadosome. Cependant, la gélatine, qui est le collagène I dénaturé, n'est pas une matrice physiologique eLement. Un nouvel essai utilisant des fibrilles de collagène de type I a été développé et utilisé pour démontrer que cette matrice physiologique est un inducteur puissant d'invadosomes. Les invadosomes qui se forment le long des fibrilles de collagène sont appelés invadosomes linéaires en raison de leur organisation linéaire sur les fibres. En outre, l'analyse moléculaire des invadosomes linéaires a montré que le récepteur 1 du domaine de la discoïde (DDR1) est le récepteur impliqué dans leur formation. Ces données démontrent clairement l'importance d'utiliser une matrice physiologiquement pertinente afin de comprendre les interactions complexes entre les cellules et l'ECM.
Introduction
Le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) se produit au cours de processus physiologiques et pathologiques tels que l'angiogenèse et l'invasion de cellules tumorales. Dans les conditions physiologiques, de nombreux types cellulaires, principalement issus de la lignée hématopoïétique, peuvent dégrader les éléments ECM. Par exemple, les macrophages sont capables de traverser les barrières anatomiques pour atteindre les tissus, et les ostéoclastes dégradent la matrice osseuse pour assurer l'homéostasie du calcium. Plus globalement, toutes les matrices du corps se renouvellent pour maintenir leurs propriétés physiques et chimiques. Dans les tissus cancéreux, la composition du micro-environnement de la tumeur est modifiée. Par exemple, dans le cancer du sein et du poumon, le collagène de type I est surexprimé et s'accumule autour de la tumeur. En outre, cette accumulation est associée à un risque accru de développer une métastase 1 , 2 . La métastase du cancer dépend de la capacité des cellules cancéreuses à dégrader l'ECM et à envahir les tissus adjacents.
leL'activité invasive des cellules est attribuée à des structures riches en actine spécialisées connues sous le nom d'invadosomes. Ce terme comprend les podosomes et les invadopodes, présents respectivement dans les cellules normales et cancéreuses ( p. Ex., Les macrophages, les cellules endothéliales et les cellules cancéreuses telles que la lignée cellulaire du cancer du sein MDA-MB-231). In vitro , les invadosomes peuvent s'organiser sous différentes formes: points, agrégats ou rosettes 3 . Classiquement, les invadosomes sont composés d'un noyau de F-actine contenant plusieurs protéines, telles que la protéine d'échafaudage Tks5 et la cortactine, entourée de molécules de plaque adhésive, telles que les intégrines et les ligatures 4 . Récemment, il a été montré que Tks5 et la RhoGTPase Cdc42 peuvent être utilisées comme minimum de signature moléculaire pour les invadosomes fonctionnels 5 . Ces structures sont capables de dégrader l'ECM par le recrutement et l'activation de protéines spécifiques de métalloprotéases, telles que MT1-MMP et MMP-2 6. Dans une étude antérieure, nous avons signalé que l'interaction entre les fibrilles de collagène de type I et le récepteur 1 du domaine de la discoïde (DDR1), un récepteur spécifique des fibrilles de collagène de type I, conduit à la formation d'une nouvelle classe d'invadosomes appelés invadosomes linéaires. Les invadosomes linéaires sont formés selon les fibrilles de collagène de type I 7 . Ces structures peuvent dégrader les fibrilles de collagène de type I par le recrutement et l'activation de MT1-MMP / MMP2. En outre, leur formation dépend de Tks5 et Cdc42 5 . In vitro , nous avons démontré l'existence d'invadosomes linéaires et l'implication du DDR1 dans leur formation et leur activité 8 en utilisant différentes stratégies consistant en une combinaison de divers éléments matriciels, notamment: i) lamelles fluorescentes revêtues de gélatine, ii) fibrilles de collagène fluorescentes de type I Couvre-lits recouverts, et iii) les bouchons de collagène 3D type I. En raison de l'utilisation de différentes matrices, nous avons pu étudier et le caractèreFormation linéaire d'invadosome et leur activité de dégradation 7 , 8 .
Enfin, pour mieux comprendre la biologie des cellules envahissantes, on a utilisé une combinaison de composants ECM dans les systèmes de culture 2D et 3D, imitant la complexité de la composition micro-ambiante tumorale. Voici des protocoles pour le revêtement des lamelles avec du collagène de gélatine / type I dans les systèmes de culture 2D et 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Classiquement, les invadosomes sont étudiés in vitro sans égard au microenvironnement et à la matrice sur laquelle les cellules sont plaquées. Plusieurs types de matrices sont actuellement utilisés, y compris la gélatine, la fibronectine, la vitronectine ou le collagène fibrillaire haute densité (HDFC) 7 , 11 ; Cependant, ce ne sont souvent pas représentatifs du microenvironnement dans lequel les cellules résident et ne sont pas pertinentes s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM a été soutenu par une bourse de doctorat de l'INSERM / Région Aquitaine et est maintenant soutenu par une bourse post-doctorale de l'ARC et l'Institut Tisch Cancer à l'École de médecine Mount Sinai. EH est soutenu par un doctorat du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE est soutenu par une bourse postdoctorale de l'Agence Nationale de Recherche (ANR). CM est soutenu par le Tisch Cancer Institute à l'École de médecine Mount Sinaï et la JJBC est soutenue par la subvention NIH / NCI K22CA196750, le Fonds JJR du Prix de la recherche scientifique du cancer TCI et l'Institut Tisch Cancer à l'École de médecine Mount Sinai. Ce travail a été soutenu par une subvention de ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS est soutenu par la "Ligue nationale contre le cancer". VM et FS sont financés par le financement de "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" et l'Institut National du Cancer, INCA_8036 et PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
Referências
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