В этом протоколе описывается, как подготовить двумерную смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагена I, и пробку 3D-коллагена I для исследования линейных интрадосом. Эти протоколы позволяют изучать формирование линейной инвадосомы, активность деградации матриц и возможности инвазии первичных клеток и линий раковых клеток.
Клеточная адгезия, миграция и инвазия участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Например, во время образования метастазов опухолевые клетки должны пересекать анатомические барьеры, чтобы вторгнуться и мигрировать через окружающую ткань, чтобы достичь кровеносных или лимфатических сосудов. Для этого требуется взаимодействие между клетками и внеклеточным матрицей (ECM). На клеточном уровне многие клетки, включая большинство раковых клеток, способны образовывать инвадусомы, которые представляют собой структуры на основе F-актина, способные разрушать ECM. Invadosomes – это протрузивные актиновые структуры, которые рекрутируют и активируют матриксные металлопротеиназы (MMP). Молекулярный состав, плотность, организация и жесткость ECM имеют решающее значение для регулирования образования и активации инвадосом. В пробирке анализ желатина является стандартным анализом, используемым для наблюдения и количественного определения активности деградации инвадосом. Однако желатин, являющийся денатурированным коллагеном I, не является физиологической матрицей element. Был разработан новый анализ с использованием коллагеновых фибрилл I типа, который показал, что эта физиологическая матрица является мощным индуктором интрадосом. Инвадосомы, которые образуются вдоль коллагеновых фибрилл, известны как линейные инвадосомы из-за их линейной организации на волокнах. Более того, молекулярный анализ линейных интрадосом показал, что рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) является рецептором, участвующим в их образовании. Эти данные наглядно демонстрируют важность использования физиологически релевантной матрицы для понимания сложных взаимодействий между клетками и ECM.
Ремоделирование внеклеточной матрицы (ECM) происходит во время физиологических и патологических процессов, таких как ангиогенез и инвазия опухолевых клеток. В физиологических условиях многие типы клеток, в основном из гематопоэтической линии, способны деградировать элементы ECM. Например, макрофаги способны пересекать анатомические барьеры для достижения тканей, а остеокласты разрушают костный матрикс для обеспечения гомеостаза кальция. Более глобально все матрицы в организме восстанавливаются, сохраняя свои физические и химические свойства. В раковых тканях состав микроокружности опухоли изменяется. Например, при раке груди и легкого коллаген I типа сверхэкспрессируется и накапливается вокруг опухоли. Более того, это накопление связано с повышенным риском развития метастазов 1 , 2 . Раковые метастазы зависят от способности раковых клеток разрушать ECM и вторгаться в смежные ткани.
Инвазивная активность клеток объясняется специализированными актино-богатыми структурами, известными как интрадосомы. Этот термин включает подзомы и инвадоподии, которые присутствуют, соответственно, в нормальных и раковых клетках ( например, макрофагах, эндотелиальных клетках и раковых клетках, таких как клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231). In vitro , интрадосомы могут организовываться в разные формы: точки, агрегаты или розетки 3 . Классически интрадосомы состоят из ядра F-актина, содержащего несколько белков, таких как белок Taff5 и кортатин, окруженный молекулами адгезионной бляшки, такими как интегрины и винкулин 4 . Недавно было показано, что Tks5 и RhoGTPase Cdc42 могут быть использованы как минимальная молекулярная сигнатура для функциональных инвадосом 5 . Эти структуры способны разрушать ECM посредством рекрутирования и активации специфических белков металлопротеазы, таких как MT1-MMP и MMP-2 6, В предыдущем исследовании мы сообщали, что взаимодействие между фибриллами коллагена типа I и рецептором домена discoidin 1 (DDR1), специфическим рецептором фибрилл коллагена I типа, приводит к образованию нового класса инвадосом, называемых линейными инвадосомами. Линейные инвадомости образуются вдоль коллагеновых фибрилл I типа 7 . Эти структуры способны разрушать фибриллы коллагена I типа путем набора и активации MT1-MMP / MMP2. Более того, их образование зависит от Tks5 и Cdc42 5 . В пробирке мы продемонстрировали существование линейных интрадосом и вовлечение DDR1 в их формирование и активность 8, используя различные стратегии, состоящие из комбинации различных матричных элементов, в том числе: i) люминесцентные покрытые желатином покровные стекла, ii) флуоресцентный коллагеновый фибрилл I типа Покрытые покровным покрытием, и iii) вилки с коллагеном типа I. Из-за использования разных матриц мы смогли учиться и характеризоватьсяА также их деградирующей активности 7 , 8 .
Наконец, чтобы лучше понять биологию инвазивных клеток, была использована комбинация компонентов ECM в системах 2D и 3D культуры, имитирующих сложность состава микроокружения опухоли. Ниже приведены протоколы покрытия покровных стекол желатином / типом I в системах 2D и 3D культуры.
Классически интрадосомы изучаются in vitro без учета микроокружения и матрицы, на которой покрыты клетки. В настоящее время используются несколько типов матриц, включая желатин, фибронектин, витронектин или фибриллярный коллаген высокой плотности (HDFC) 7 , …
The authors have nothing to disclose.
JDM поддерживалась стипендией PhD от INSERM / Région Aquitaine и в настоящее время поддерживается последипломным отделением ARC и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. EH поддерживается доктором философии от Министерства обороны и де ла Recherche. ZE поддерживается пост-докторской стипендией от Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM поддерживается Институтом рака Тиша в Медицинской школе горы Синай, а JJBC поддерживается грантом NIH / NCI K22CA196750, Фондом JJR Фонда исследований рака молочной железы TCI и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. Эта работа была поддержана грантом ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS поддерживается «Национальной лигой борьбы с раком». VM и FS поддерживаются при финансовой поддержке «Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016» и Национального института рака, INCA_8036 и PLBio2012.
Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
Dilution :1/100 | |||
Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |