2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.
Abstract
הדבקה תאית, הגירה ופלישה מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. לדוגמה, במהלך היווצרות גרורות, תאים סרטניים צריכים לחצות מחסומים אנטומיים כדי לפלוש ולהעביר דרך הרקמה הסובבת כדי להגיע דם או כלי הלימפה. זה דורש את האינטראקציה בין תאים מטריצה תאיים (ECM). ברמה התאית, תאים רבים, כולל רוב תאי הסרטן, מסוגלים ליצור אינבאדוזומים, שהם מבנים המבוססים על F-actin המסוגלים להשפיל ECM. Invadosomes הם המבנים אקטין פולשנית כי לגייס ולהפעיל metalloproteinases מטריצה (MMPs). ההרכב המולקולרי, הצפיפות, הארגון והקשיחות של ה- ECM הם קריטיים בוויסות של היווצרות ואינדואדום. במבחנה , assay ג'לטין הוא assay תקן המשמש להתבונן לכמת פעילות השפלה invadosome. עם זאת, ג'לטין, שהוא קולגן מפוגל, אני לא מטריצה פיזיולוגית ה. Assay הרומן באמצעות סוג אני fibrils קולגן פותחה והשתמשו כדי להוכיח כי זה מטריצה פיזיולוגית הוא inducer חזק של invadosomes. Invadosomes טופס לאורך fibrils קולגן ידועים כמו invadosomes ליניארי בשל הארגון ליניארי שלהם על הסיבים. יתר על כן, ניתוח מולקולרי של אינבדוזום ליניארי הראה כי קולטן תחום discoidin 1 (DDR1) הוא הקולטן המעורבים היווצרות שלהם. נתונים אלה ממחישים בבירור את החשיבות של שימוש במטריצה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית על מנת להבין את האינטראקציות המורכבות בין התאים לבין ה- ECM.
Introduction
מטריקס תאיים (ECM) שיפוץ מתרחשת במהלך תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כגון אנגיוגנזה ותאי הפלישה של תאים. בתנאים פיזיולוגיים, סוגי תאים רבים, בעיקר מן השושלת ההמטופויטית, מסוגלים להשפיל אלמנטים של ECM. לדוגמה, מקרופאגים מסוגלים לחצות מחסומים אנטומיים להגיע רקמות, ו osteoclasts לבזות מטריקס עצם כדי להבטיח הומיאוסטזיס סידן. יותר גלובלי, כל המטריצות בגוף מתחדשות כדי לשמור על התכונות הפיסיקליות והכימיות שלהן. ברקמות סרטן, הרכב microenvironment הגידול משתנה. לדוגמה, בסרטן השד והריאות, הקלד אני קולגן overexpressed ו מצטבר סביב הגידול. יתר על כן, הצטברות זו קשורה בסיכון מוגבר לפתח גרורות 1 , 2 . גרורות סרטן תלויה ביכולתם של תאים סרטניים להשפיל את ה- ECM ולפלוש לרקמות סמוכות.
הפעילות פולשנית של תאים מיוחסת מבנים עשירים אקטין מיוחדים הידועים בשם invadosomes. מונח זה כולל podosomes ו invadopodia, אשר נמצאים, בהתאמה, בתאי סרטן נורמלי ( למשל, מקרופאגים, תאי האנדותל, תאים סרטניים כגון MDA-MB-231 תאי סרטן השד). במבחנה , invadosomes יכול להתארגן לצורות שונות: נקודות, אגרגטים, או שושנות 3 . באופן קלאסי, אינבדוזומים מורכבים מליבה F- אקטין המכילה מספר חלבונים, כגון חלבון הפיגום Tks5 וקורטקטין, המקיפים מולקולות פלאק של הדבקה, כגון אינטגרינים ווינקולין 4 . לאחרונה, הוכח כי Tks5 ואת RhoGTPase Cdc42 יכול לשמש כחתימה מולקולרית מינימלית עבור invadosomes תפקודית 5 . מבנים אלה מסוגלים להשפיל את ECM באמצעות גיוס והפעלה של חלבונים metalloprotease ספציפיים, כגון MT1-MMP ו MMP-2 6. במחקר קודם, דיווחנו כי האינטראקציה בין סיבי קולגן מסוג 1 לבין קולטן דסקוידין 1 (DDR1), קולטן ספציפי מסוגי סיבי קולגן מסוג 1, מוביל להיווצרותו של סוג חדש של אינבדוזומים, הנקראים אינבאדומים ליניאריים. Infadosomes ליניארי נוצרות לאורך סוג אני fibrils קולגן 7 . מבנים אלה מסוגלים לבזות סוג אני קולגן fibrils באמצעות גיוס והפעלה של MT1-MMP / MMP2. יתר על כן, היווצרות שלהם תלויה Tks5 ו Cdc42 5 . במבחנה , הפגינו את קיומם של אינבדוזומים ליניאריים ומעורבות DDR1 בהיווצרותם ובפעילותם 8 באמצעות אסטרטגיות שונות המורכבות משילוב של אלמנטים מטריקס שונים, ביניהם: i) פלורסנט מצופה ג 'לטין coverslips, II) סוג פלואורסצנטי אני קולגן fibril מצופה coverslips, ו iii) סוג 3D אני קולגן plugs. בשל השימוש במטריצות שונות, הצלחנו ללמוד ולאפייןIze היווצרות invadosome לינארי ואת פעילות השפלה שלהם 7 , 8 .
לבסוף, כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של תאים פולשניים, שילוב של רכיבי ECM בשתי מערכות 2D ו 3D תרבות שימשו, מחקה את המורכבות של הרכב microenvironment הגידול. להלן פרוטוקולים coverslips ציפוי עם ג'לטין / סוג קולגן אני במערכות התרבות 2D ו 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן קלאסי, invadosomes נלמדים במבחנה ללא קשר microenvironment ואת המטריצה שבה התאים מצופים. כמה סוגים של מטריצות משמשים כיום, כולל ג'לטין, פיברונקטין, vitronectin, או בצפיפות גבוהה פיברילר קולגן (HDFC) 7 , 11 ; עם זאת, אלה הם לעתים קרובות לא נציג של mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM נתמכה על ידי מלגת הדוקטורט מ- INSERM / Région Aquitaine ונתמכת כיום על ידי פוסט-דוקטורט של שותפות ARC ומכון הסרטן טיש בבית הספר לרפואה של הר סיני. EH נתמך על ידי דוקטורט מ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE נתמך על ידי פוסט דוקטורט מלגה מן הסוכנות הלאומית de la Recherche (ANR). CM נתמכת על ידי מכון טיש לסרטן בבית הספר לרפואה של הר סיני ו JJBC נתמך על ידי מענק NIH / NCI K22CA196750, TCI מדענים צעירים פרס הסרט JJR קרן, ואת מכון טיש סרטן בבית הספר הר סיני לרפואה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS נתמך על ידי "Ligue nationale contre le סרטן". VM ו- FS נתמכים על ידי מימון של "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" ו- Institut National du Cancer, INCA_8036 ו- PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
Referências
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
