Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas
Summary
Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Abstract
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
Introduction
Defeitos na cartilagem articular não curam naturalmente. Consequentemente, transplante de células estaminais tem sido proposto como uma abordagem promissora para a reparação de cartilagem deficiente. No entanto, este método requer a aquisição de um número suficiente de células estaminais e a indução destas células para sofrerem diferenciação condrogénica. medula óssea (MO) tem sido amplamente utilizado como uma fonte de células estaminais, mas o isolamento de células a partir de BM tem duas grandes desvantagens: a invasividade e rendimento insuficiente. Devido à sua facilidade de aquisição, o tecido adiposo é uma fonte preferida de células estaminais. Estudos anteriores demonstraram a possibilidade de isolar as células estaminais a partir de tecido adiposo e indução da diferenciação condrogénica nestas células utilizando citoquinas, tais como TGF-β1 1, 2. Esses métodos são eficazes, mas caro.
Como uma alternativa de baixo custo para as citocinas, a tensão mecânica pode ser usado parainduzir a diferenciação condrogênica. Carga mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da saúde da cartilagem articular 3, e pode induzir fenótipos condrogênicos em várias células. Por exemplo, a pressão hidrostática induz fenótipos condrogênicos em células progenitoras derivadas de sinóvia por meio da via da MAP-cinase / JNK 4, e a compressão mecânica induz condrogénese em células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) por regulação positiva de genes condrocítico 5. Além disso, a tensão de cisalhamento contribui para a expressão de matriz extracelular relacionada com a condrogénese (ECM) em 6 MSCs humanas. Centrífuga gravidade (CG), um stress mecânico controlado facilmente aplicada e gerado por centrifugação, pode induzir a expressão diferencial de genes em células de 7. Por exemplo, em células de carcinoma epitelial de pulmão, a expressão de interleucina (IL) -1-B é regulado positivamente por centrifugação 8. Tor conseguinte, como um stress mecânico experimentalmente indutível, CG pode ser utilizado para induzir a expressão de genes em células estaminais condrocítico. No entanto, não fica claro se CG pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco.
Neste estudo, descobrimos que CG induziu a regulação positiva de SOX9, um regulador mestre da chondrogenesis, no ASC humanos, resultando na superexpressão de genes condrocítico. Além disso, comparou-se os efeitos de CG em condrogénese com aqueles de TGF-β1, o factor de crescimento mais comumente usado para induzir a condrogénese in vitro em células estaminais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estado stemness de células é muito importante para a superexpressão induzida por CG de SOX9. Em nosso estudo, a expressão SOX9 poderia ser induzida por CG na ASC cedo-passagem (2-3), mas não no ASC depois-passagem. Tem sido relatado que, durante o cultivo, ASC conter células CD34 + 3 até 16 passagens. ASC tendem a perder a expressão de CD34 como as células são passadas, resultando em uma baixa resposta de CG.
Com força da gravidade centrífugo, a pressão…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |
Referências
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