Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l'aide d'un<em> In vitro</em> système
Summary
Ce protocole décrit des techniques pour la quantification et la caractérisation des aberrations chromosomiques in vitro dans les macrophages murins RAW264.7 après le traitement avec la matière particulaire de l' air ambiant.
Abstract
L'exposition aux matières particulaires (PM) est un problème majeur de santé dans le monde, ce qui peut endommager divers composants cellulaires, y compris le matériel génétique nucléaire. Pour évaluer l'impact des PM sur l'intégrité génétique nucléaire, des aberrations chromosomiques structurelles sont notées dans les spreads métaphase de cellules macrophages RAW264.7 de la souris. PM est recueillie à partir de l'air ambiant avec un échantillonneur de particules totale de volume élevé suspendu. Le matériel recueilli est solubilisé et filtré pour retenir la portion bien soluble dans l'eau. Les particules sont caractérisées par la composition chimique par résonance magnétique nucléaire (RMN). Différentes concentrations de suspension de particules sont ajoutés sur une culture in vitro de macrophages de souris RAW264.7 pendant une durée totale d'exposition de 72 heures, ainsi que des cellules témoins non traitées. A la fin de l'exposition, la culture est traitée avec colcémide pour arrêter les cellules en métaphase. Les cellules sont ensuite récoltées, traitées avec une solution hypotonique, fixée dans acetomethanol, dropped sur des lames de verre et enfin colorées avec une solution Giemsa. Les lames sont examinées pour évaluer les aberrations chromosomiques structurelles (CA) en métaphase se propage à 1,000X grossissement à l'aide d'un microscope à champ clair. 50 à 100 métaphase propagation sont marqués pour chaque groupe de traitement. Cette technique est adaptée pour la détection des aberrations de structure chromosomiques (CA), tels que les pauses de type chromatide, des échanges de type chromatide, des fragments acentriques, chromosomes dicentriques et anneaux, doubles minutes, endoreduplication et translocations in vitro après l' exposition au PM. Il est une méthode puissante pour associer un critère d'évaluation cytogénétique bien établie de modifications épigénétiques.
Introduction
Il a été estimé que l' exposition aux particules (PM) provoque plus de 3 millions de décès supplémentaires par an, principalement de maladies cardio – pulmonaires et le cancer du poumon 1. En effet, PM a été reconnu comme cancérogène pour l' homme par l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer (Groupe 1), a montré un risque accru de cancer du poumon avec l' augmentation des niveaux d'exposition aux PM 2. Fait intéressant, presque toutes les cellules cancéreuses abritent des anomalies chromosomiques numériques et / ou structurelles. carbone organique particulaire est une variante, complexe et mélange hétérogène, dont la composition et la taille de distribution dépend des émissions ainsi que des transformations physiques et chimiques. Il représente 35-55% des zones urbaines masse des PM 2,5 (PM 2,5 um et moins) et plus de 60% du milieu rural et continental PM 2,5 masse 3, 4. représente la fraction soluble dans l'eau pour 30-90% des aérosols organiques. Un grand nombre de composés organiquesont été identifiées, y compris les hydrocarbures aliphatiques, les hydrocarbures aromatiques polycycliques et leurs dérivés oxygénés et nitrés, des aldéhydes et des alcools aliphatiques, des acides gras libres et leurs sels, les acides di-carboxyliques, des composés multifonctionnels, des protéines et macromolécules humiques-like (HULIS) en utilisant des méthodes chromatographiques associées à des techniques de spectrométrie de masse 5-8. Ces composés représentent moins de 10-20% de carbone organique particulaire, donc la plupart du carbone organique est inconnu 9.
Des preuves expérimentales suggèrent que la cytotoxicité, le stress oxydatif et l'inflammation sont impliqués dans le développement d'états pathologiques associés PM-. Il a été récemment montré, cependant, que l' exposition aux particules entraîne également un certain nombre de modifications épigénétiques, y compris des altérations de méthylation de l' ADN d'éléments répétitifs, à la fois expérimental dans des systèmes in vitro et chez des sujets humains 10-12. D'un intérêt particulier sont les effetsPM sur l'ADN par satellite – grands et petits satellites – qui se trouvent dans la région hétérochromatique autour du centromère des chromosomes. Il a été montré que ces effets peuvent être persistants par la nature, car ils peuvent être détectés pendant au moins 72 heures après l' exposition 12. Les modifications de méthylation de l' ADN, en particulier autour de centromères, peuvent entraîner une accumulation de transcrits d'ARNm d'ADN par satellite, l' intégrité chromosomique de compromis lors de la division cellulaire et, par la suite, se traduire par le développement d'une variété d'états pathologiques 13.
Adaptation de l'approche cytogénétique pour l'analyse des CA en tant que point final des altérations épigénétiques causés par PM, donc, est d'une grande importance. Nous rapportons ici l'approche de la collecte de PM ambiante et de la préparation, l'exposition in vitro et l' analyse des CA en utilisant le système de modèle de RAW264.7 de macrophage murin. Macrophages comprennent la première ligne de défense contre les corps étrangers inhalés et, par conséquent, tsa lignée cellulaire sert d'établi et le modèle le plus fréquemment utilisé en toxicologie des particules 11, 12, 14, 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
étude cytogénétique ou analyse microscopique des nombres ou des structures de chromosomes, principalement dans les écarts de métaphase, fournit des informations cruciales pour le pronostic, l'évaluation des risques, et le traitement de diverses maladies. Il est maintenant bien établi que les anomalies cytogénétiques sont liées à la progression et le développement de plusieurs maladies, y compris le cancer. À ce jour, les CA ont été trouvés dans tous les types de tumeurs majeurs. Les CA peuvent surven…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu en partie par l'Institut national du Centre de santé d'excellence de recherche biologique [numéro de subvention 1P20GM109005], le Grant Consortium Arkansas Espace par la National Aeronautics and Space Administration [numéro subvention de NNX15AK32A], et l'Institut national pour la sécurité et Santé (NIOSH) [numéro de subvention 2T420H008436]. Les auteurs tiennent à remercier Christopher Fettes pour la relecture et l'édition de ce manuscrit.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
Referências
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