Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

Summary

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Abstract

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Introduction

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems¹. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine².

Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery³, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)⁴, and electroporation⁵ or polyethylene glycol⁶ treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results⁷. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates⁸. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.

Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer⁹. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.

Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy^10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes^15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic^18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria²¹ or plastids (chloroplasts)²² for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins²³ and either express (plasmid^21,24 or double-stranded DNA²⁵) or down-regulate (double-stranded RNA²⁶) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space^24-26 or within a specific organellar compartment²¹. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K₈) or polylysine-co-histidine (KH)₉ for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

Protocol

1. Подготовка на основе пептидов рецептур Подготовка исходных растворов каждого пептида следующим образом : (КН) 9 -BP100 (1 мг / мл или 800 нМ), Cytcox- (КН) 9 (1 мг / мл), BP100 (1 мг / мл) и (BP100) 2 К 8 (70 мкМ). Взвешивают необходимое количество каждого пептида в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавьте автоклавированы сверхчистой воды для растворения пептида. Хорошо перемешайте повторным пипетированием до тех пор, пока не будет получен прозрачный раствор. Усиливаются и очищают плазмиды ДНК (плазмидной), двухцепочечной ДНК (дц) и двухцепочечной РНК (дцРНК) в соответствии со стандартными методиками молекулярных. В 1,5 мл микропробирок, делают маточные растворы с концентрацией 1 мг / мл (PDNA и дцДНК) или 400 нм (дцРНК). Подготовка белка маточного раствора с концентрацией 7 мкМ, растворением 1 мг белка (например., Алкогольдегидрогеназы, АДГ) порошка в 1 мл раствора карбоната натрия (0,1 М, рН 9). Добавьте белок с Fluorescent зонды, такие как родамина В (RhB) в соответствии со стандартными протоколами, с тем чтобы микроскопическую визуализацию белка, доставляемые в клетки. Объединяют соответствующие компоненты в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Для получения пептида-PDNA рецептуры нацеливание цитоплазму, добавьте 6,4 мкл (KH) 9 -BP100 (1 мг / мл) до 20 мкл плазмидной (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 773,6 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Используйте пДНК конструкцию , предназначенный для ядерной экспрессии (P35S-RLuc-TNOs, таблица 1). Для получения пептида-PDNA Препараты нацеливание митохондрии, добавляют 6,6 мкл Cytcox- (KH) 9 (1 мг / мл) до 20 мкл плазмидной (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° С и затем добавляют 2,4 мкл BP100 (1 мг / мл). Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при температуре 256; С в течение еще 15 мин. Добавить 771 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Используйте пДНК конструкцию , предназначенный для митохондриальной выражения (pDONR-COX2: rluc, таблица 1). Для составов пептид-дцДНК, добавляют 5,1 мкл (KH) 9 -BP100 (1 мг / мл) до 8 мкл двухцепочечной ДНК (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 786,9 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Для составов пептид-дцРНК, добавляют 50 мкл (KH) 9 -BP100 (800 нм) до 50 мкл дцРНК (400 нМ) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавьте 700 мкл РНКазы воды, чтобы разбавить раствор до конечного объема 800 мкл. Для составов пептид-белок, добавить 16 мкл (BP100) 2 K 8 (70 мкМ) до 16 мкл АДГ (7 мкм) и смешатьхорошо пипеткой. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 768 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Разрешить Препараты для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. 2. Характеристика основе пептидов рецептур Передача каждого раствора (800 мкл) в кювету для динамического рассеяния света (DLS) анализа. Определить индекс гидродинамический диаметр и полидисперсности образованных комплексов с дзета Nanosizer, используя 633 нм He-Ne-лазера при 25 ° С с углом обнаружения обратного рассеяния 173 °. После измерения размера, передача каждого раствора (800 мкл) в сложенное капиллярной ячейки для измерения дзета-потенциала на параметры по умолчанию диэлектрической проницаемости, показатель преломления и вязкость воды при 25 ° С. Обратите внимание небольшой объем раствора комплекса, используемого для анализа DLS, методом атомно-силовой микроскопии (AFM). Депозит 10 мкл раствора комплекса на свеже открытой поверхности скола слюды листа и оставить слюду высохнуть на воздухе в течение ночи в закрытой пластиковой чашке Петри. Получения изображения комплексов в воздухе при 25 ° С с использованием кремниевого кантилевера с пружинной константой 1,3 Н / м в режиме 27,28 нарезание резьбы. 3. Проникновение листьев растений Используйте 3 – недельных почвы выращенных растений (Резуховидка Таля 24, Nicotiana benthamiana 24 или тополь 26). Трансфекцию по крайней мере 3 листьев, чтобы служить в качестве трех экземплярах для количественного определения экспрессии гена или белка доставки. Нагрузка 1 мл безыгольного пластиковый шприц с 100 мкл раствора комплекса для трансфекции одного листа. Поместите кончик шприца на абаксиальной поверхности листа. Нажмите наконечник шприца против листа слегка и нажмите на поршень шприца медленно в то время оказывая встречное давление с INDEX палец латексной перчатке с противоположной стороны. Успешное инфильтрации можно наблюдать, как растекание воды пропитанной области в листе. Этикетка проникших листья для облегчения идентификации. Выдержите трансфи- лист для оптимизированных длительностей следующие инфильтрации с пептидом-пДНК (12 ч), пептид-дц (12 ч), пептид-дсРНК – рецептур (9 48 ч) и пептид-белок (6 ч) при следующих условиях: 16 ч света / 8 ч темноты при 22 ° С для А. thaliana и тополя, или 24 ч постоянного света при 29 ° С для N. benthamiana. 4. Оценка эффективности трансфекции Акцизный весь трансфи- лист мелких растений (например., A. thaliana) или раздел 1 см 2 инфильтрированного области для более крупных растений (например., Н. benthamiana). Для экспериментов с трансфекцией с использованием Renilla люциферазы (Rluc) репортер вектор, определить transfectioп эффективность количественно с использованием набора Rluc анализа. Поместите каждую вырезанную лист или лист в секцию трубки микроцентрифужных 1,5 мл. Добавьте 100 мкл 1 × Rluc пробирной лизирующего буфера на пробирку. Таким же образом, готовить лизаты не-трансфецировали листьев контрольных (в трех повторах). Измельчите лист, используя гомогенизацию пестиком и инкубировать результирующую лизат при температуре 25 ° С в течение 6 – 10 ч. Центрифуга лизат при 12,470 × г в микроцентрифуге в течение 1 мин. Передача 20 мкл очищенного лизата в лунку в 96-луночный микропланшет, а также использовать оставшийся объем для количественного определения общей концентрации белка с использованием набора для анализа BCA Protein в соответствии с протоколом производителя. Добавьте 100 мкл 1 × Rluc пробирной субстрата (разводили с использованием Rluc буфером для анализа) в скважину и перемешать с помощью медленного пипеткой. Поместите планшет в планшет-ридере многомодового и начать измерение. Вычтите фоновое свечение (среднее значение такого нетн-трансфицировали трех экземплярах) от люминесценции каждого экспериментального образца. Рассчитать отношение фотолюминесценции (относительных световых единицах, RLU) на количество белка (мг). Для экспериментов с трансфекцией с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортер вектора или флуоресцентно меченого белка (например., АДГ-RhB), наблюдать флуоресценцию с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Обрежьте края целого листа (для облегчения удаления воздушных прослоек), в то время как секционная лист может быть использован как таковой. Извлекают поршень из шприца 10 мл и поместить каждую вырезанную листьев или листьев участок в шприце. Заменить плунжер и толкать его осторожно на дно шприца без дробления листа. Draw воду в шприц до тех пор, пока не будет приблизительно наполовину заполнена. Направить шприц вверх и нажать на поршень, чтобы удалить воздух из шприца через наконечник. Накройте кончик шприца и потяните поршень вниз медленно, чтобы удалить воздух из LEAе. Повторите эту процедуру несколько раз, пока лист не появится полупрозрачная. Покройте поверхность предметного стекла микроскопа с помощью клейкой ленты. Вырежьте квадратную область на ленте достаточно большой, чтобы вместить образец листа с помощью ножа, и кожура квадратный кусок ленты от пинцетом, чтобы создать образец камеры. Лента будет служить в качестве прокладки между предметным и покровным. Поместите лист в камере с абаксиальной поверхностью, обращенной вверх, и заполнить оставшуюся площадь камеры с водой. Печать листа внутри камеры с покровным стеклом и закрепить края покровного стекла с помощью клейкой ленты. Осмотрите образец листа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии под объективом 40х или иммерсионный объектив 63X воды. GFP или RhB флуоресценции могут быть визуализированы при возбуждении длины волны 488 нм или 555 нм, соответственно.

Representative Results

Массив кислот и белков грузов нуклеиновых были успешно внедрены в различных растений с использованием разработанных пептидов в качестве векторов доставки. Электростатическое взаимодействие между катионными пептидами и отрицательно заряженных грузов привело к образованию комплексов трансфекции , которые могут быть непосредственно инфильтрации в листьях растений с помощью безыгольного шприца (Рисунок 1). Оптимизированные рецептуры (эмпирически определенные в этих исследованиях 21,23-26) для трансфекции клеток растений, перечислены в таблице 1, где представлен каждый тип широкого спектра поставляемых грузов (пДНК, дцДНК, дцРНК и белок). Средние диаметры всех пептидных на основе рецептур в диапазоне приблизительно от 150 – 300 нм. На основе анализа DLS, все составы показаны относительно низкие полидисперсность размера, что указывает, что агрегаты, образованные пептид-грузовой имеют равномерное распределение по размерам. Морфологиякомплексов между пептидом и пДНК (Рисунок 2А) или белка (рис 2В), на слюду, были обследованы с помощью атомно – силовой микроскопии. Однородные шаровидные комплексы наблюдались для обоих пептидных-пДНК и пептид-белковых комбинаций, в согласии с данными измерений DLS. С точки зрения дзета – потенциала комплексов (таблица 1), pDNA- и дц-полученные комплексы были чистые заряды отрицательной поверхности в то время как дсРНК на основе комплексов была почти нейтральной поверхностный заряд. Пептид-белковых комплексов, с другой стороны, были положительно заряженными. Эффективности пептид-пДНК и рецептур пептид-дцДНК в опосредовании трансфекцию A. thaliana или N. benthamiana в качестве модельных систем растений оценивали количественно, а также качественно. Экспрессия гена анализа RLuc использовали для количественной оценки уровней экспрессии генов (таблица 1), поэтому для этого эксперимента плазмидной илидц, кодирующий ген RLuc должен быть использован для комплексообразования с соответствующими пептидами-носителями. Используя (KH) 9 -BP100 / рецептура пДНК, ядерно-направленной доставки и экспрессии плазмидной может быть достигнуто, после инкубационного периода продолжительностью в 12 часов, с предполагаемой RLU / мг значения приблизительно 1 × 10 5. Для митохондриальной-направленной доставки и экспрессии плазмидной, сочетание пептидов, Cytcox- (KH) 9 и BP100, требуется для образования комплекса. С тем же самым оптимизированным инкубационного периода в 12 часов, однако, намного более низкий уровень трансфекции (примерно 1 × 10 3 о.е. / мг) была достигнута. В то же время, требовалось подобное Инкубационный период (12 ч) и уровень экспрессии гена (приблизительно 1 × 10 3 RLU / мг) / регистрируются для комплексов дц на основе, а также сформулированы с использованием (KH) 9 -BP100 пептида. Качественные оценки экспрессии генов проводили путем прямого микроскопического наблюдения листьев, обработанных комплексов ДГОред использованием пДНК или дц, кодирующий ген GFP-репортер. В клетках , трансфицированных нецелевых пептид-пДНК комплексов, диффузный зеленую флуоресценцию , соответствующую экспрессию GFP отчетливо наблюдалась и нашел для локализации в цитоплазме (рис 3А). Четкие различия в характере локализации флуоресценции GFP были очевидны в клетках, внедренных с митохондриальных-мишенью пептид-пДНК комплексов. Здесь, точечное зеленая флуоресценция , которая локализуется с митохондриальной пятно было видно, что подтверждает специфичность экспрессии генов исключительно в митохондриальной отделении клеток (фиг.3В). В случае препаратов пептид-белок, конъюгирование белка груза (АДГ) до флуорофор (RhB) позволит получать визуализацию поставляемого белка в внутриклеточное. В течение короткого инкубационного периода от 6 ч, был обнаружен белок АДГ-RhB (синий), которые будут распределены по всемуцитозоль и вакуоли проникших клеток (рис 3C). В то же время, быстрое и эффективное понижающая регуляция экспрессии генов может быть достигнуто в различных растениях с использованием составов пептид-дцРНК. В первом эксперименте, А. thaliana листьев пропитывали с пептидной-дсРНК комплексов , чтобы заставить замолчать ген халкон – синтазы (CHS) , ответственные за антоцианов (красный пигмент) биосинтеза в условиях засухи. Разница во внешности A. thaliana листьев при нормальных условиях (рис 3D, а) и засухи (рис 3D, б) при условии легкое средство для оценки CHS заглушающие с использованием оптимизированной рецептурой пептид-дсРНК (стрелка 1 указывает на пропитанную область). Во втором эксперименте, пептид-дцРНК комплексы проникали в листьях трансгенного A. thaliana , экспрессирующих желтого флуоресцентного белка (YFP). Явное снижение экспрессии YFP можно было увидеть в клетках эпидермиса 9 ч рОСТ-трансфекцию (рис 3E, F). Эффективность препарата в экспрессии гена понижающего регулирования в другой системе растений (тополь, 12 ч после трансфекции) была также проверена (рис 3G, H). Рисунок 1: Пептид основе Препараты для доставки нуклеиновых кислот и белков грузам в живых растений. Разработанные пептиды-носители состоят из поликатионов, конъюгированных с клеточной проникающего или органелл последовательностей транзита. Поликатионы дают возможность связывания и / или конденсация отрицательно заряженных грузов, а также побег из эндосомный отсека следующие интернализации в клетки. Доставка грузов в клетки, а затем в специфических органеллах опосредуется клеток проникающего последовательностей и последовательностей органелл транзита, соответственно. Различные грузы, которые могут быть successfuLLY доставлены в растение включают нуклеиновые кислоты, такие как пДНК, дцДНК и дцРНК, а также модельные белки, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА), алкогольдегидрогеназы (АДГ) и цитрин (вариант желтого флуоресцентного белка). Биоактивные молекулы способны образовывать комплексы с трансфекцию пептидных конъюгатов через электростатических взаимодействий, которые вводятся в листьях растений с помощью шприца инфильтрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2: Морфология основе пептидов Рецептуры. (A) AFM амплитуда изображения (KH) 9 -BP100 композиции / пДНК при N / P 0,5. (B) Высота AFM изображение (BP100) 2 K 8 / препарата АДГ при молярном ратиO 10. Воспроизводится с разрешения из опубликованных источников 23,24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: микроскопическая оценка трансфекционного Efficiencies с оптимизированной пептидной основе рецептур. (А) выражение цитозольного GFP (зеленый), четко отличать от хлоропластов автофлюоресценции (красный), наблюдалось в губчатой мезофильных клетках A. thaliana листьев инфильтрации (KH) 9 композиции -BP100 / пДНК (N / P 0,5; 12 ч ). (B) выражение GFP (зеленый) был обнаружен в митохондриях (красный) в эпидермальных клетках A. thaliana листьев инфильтрации Cytcox- (KH) 9 / BP100 композиции / пДНК (N / P 0,5 для каждого пептиде; 12 ч). Увеличенные изображения митохондрий с выражением GFP показаны в крайнем правом панели. (С) Поставка ADH-RHB (синий) в губчатую мезофильных клетках A. thaliana листьев опосредована (BP100) 2 К 8 при мольном соотношении пептид / белок , 10, визуализируются 6 ч после инфильтрации. (D) A. thaliana листьев до (а) и после (б) обработки (KH) 9 -BP100 / препарат дсРНК (мольное отношение 2; 48 ч), что привело к подавлению биосинтеза антоцианов. Аналогичный препарат , содержащий GFP5 дсРНК пропитывали в лист в качестве отрицательного контроля (с). Стрелки 1 и 3 показывают инфильтрированного область в то время как стрелки 2 и 4 указывают на не-инфильтрированного область внутри листа. (Е) А. thaliana листьев выражения желтого флуоресцентного белка (YFP) и (F) Уменьшенный YFP флуоресценции следующую инфильтрации (КН) 9 -BP100 / дсРНК рецептура (мольное отношение 2; 9 ч). (G) Трансгенные листьев тополя , выражающие желтый флуоресцентный белок (YFP) и (H) уменьшенная YFP флуоресценции следуя инфильтрация (KH) 9 -BP100 / дсРНК формулировка (мольное отношение 2, 12 ч). Воспроизводится с разрешения из опубликованных источников 21,23,24,26. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: Изменение пептидом-к-ДНК (N / P) Соотношение и влияние на биофизические свойства комплексов. С увеличением пептида с соотношением ДНК, составы на основе пептидов уменьшаются в размерах в то время как их дзета-потенциал значений перехода от отрицательного к положительному./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Таблица 1: Характеристика и оценка различных композиций на основе пептидов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы. Таблица 2: Сравнение на основе пептидов и других существующих технологий ДНК для доставки интактных растений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Discussion

Критические шаги в рамках протокола, которые были определены эмпирически обсуждаются. С помощью шприца инфильтрации, препараты на основе пептидов, вводятся в воздушном пространстве внутри листа растения через устьица. Для того, чтобы обеспечить максимальное поглощение раствора, процесс инфильтрации следует проводить , когда растения в условиях, которые способствуют устьичным открытию то есть., При условии , с достаточным количеством воды и в течение светового периода. Что касается подготовки трансфекцию комплексов, для составов, которые включают комбинацию двух пептидов (для доставки ДНК митохондриальной-мишенью), последовательность для добавления каждого компонента имеет решающее значение и не должна быть перевернутой.

Есть много правдоподобных изменения в процедуре. Еще один вариант для инфильтрации клеток растений является использование вакуумной пропитки, которая способна ввести комплексное решение в целые растения и / или частичной тканей, включаяапикальные меристемы. Для этой альтернативной процедуры, рассаду погружают в раствор для трансфекции, а также на основании давления, создаваемого вакуума, пептид-грузовые комплексы вынуждены через устьица и в клетках растений (Yoshizumi, T., неопубликованные данные).

Кратковременная экспрессия гена, основанный на исследованиях с использованием животных клеток, было показано , что увеличение с более высокими концентрациями ДНК ^29-31. Важно отметить , что отношение пептида к ДНК влияет на биофизические свойства (размер, поверхность заменяющим ) комплексов (рис 4), который влияет на эффективность трансфекции; следовательно, оптимальное соотношение должно поддерживаться даже с повышенной концентрацией ДНК.

Одним из главных преимуществ в использовании пептидов, как ген / белок агента доставки является то, что его последовательность поддается настройке для выполнения требуемой функции. Например, митохондриальная-направляющий домен пептида-носителя описано в данном шпилькеу может быть заменен хлорпластического или пероксисом нацеливания последовательностей для локализации этих органелл. В то время как трансформация хлоропластов возможно в нескольких растений с использованием биолистики ^32-34, ни Agrobacterium , ни биолистической метод может ввести гены в митохондрии или других органеллах , помимо ядра (таблица 2).

Там нет жестких ограничений хост-диапазона для пептидной основе трансфекции, в отличие от метода Agrobacterium -На (таблица 2). До сих пор, составы для трансфекции A. thaliana, Н. benthamiana и тополя были оптимизированы (таблица 1), но метод может быть применен для Nicotiana аЬасит, томатный сорт Микро-Том, рис (на основе предварительных экспериментов), и другие моно- и двудольных растений.

Пока еще не существует известное ограничение размера трансгена, когда пептиды используютs трансфекции векторов. В противоположность этому , большие молекулы ДНК было обнаружено, что снижает эффективность трансформации Agrobacterium опосредованной методов ^35,36, а верхний предел размера для трансгенов приблизительно 200 кб было сообщено ^37-39. Использование биолистики, с другой стороны, большие ДНК – фрагменты могут быть стриженый во время приготовления или доставки в растения ^38. Хотя верхний предел не был определен для баллистической трансформации до сих пор, физические сдерживает были найдены , чтобы ограничить размер ДНК , которые могут быть переданы намного меньше , чем 150 кб ^40. Основные преимущества использования системы на основе пептидов для переноса генов по сравнению с существующими подходами по принципу либо Agrobacterium или бомбардировки микрочастицами, рассмотренных выше, приведены в таблице 2.

существует несколько ограничений для этого метода в его нынешнем виде. Во-первых, направленную доставку пДНК к конкретным органелл, таких как МИТochondria, было доказано, возможно, с помощью простого сочетания ДНК-связывающих клеток, проникающих и органелл транзитных последовательностей хотя эффективность была низкой. экспрессии трансгена может быть обнаружена, с помощью конфокальной микроскопии, только в небольшой популяции митохондрий в клетках. Следовательно, дальнейшие модификации необходимы для: (I) повышения транслокацию более комплексов через клеточную / органоидного мембраны, и (II), улучшение диссоциации и передачи пДНК от пептида-носителя в целевую органеллы для экспрессии. Во-вторых, с помощью этой системы доставки ДНК, временной экспрессии экзогенных генов репортер был успешно достигнут в цитозольной и митохондриальной отделении клеток. Стабильное включение и экспрессия введенных генов в растении ядерном / органоидного генома еще не были установлены, однако, из-за отсутствия подходящих стратегий отбора.

Признавая, что есть области для улучшения или дальнейшего гАЗВИТИЕ, стратегия пептид, полученных описанным здесь остается простой и универсальный метод, который проложил путь для доставки различных грузов в различных видах растений.

Materials

(KH)9-BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mL and 10 mL Plastic Syringes	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
1.5 mL Microcentrifuge Tube	AS ONE Corporation	151212
96-Well Flat-Bottom Plate	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Adhesive Tape	Sekisui Chemical Co., Ltd.	No. 835
Alcohol Dehydrogenase	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Atomic Force Microscope	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvette	Sarstedt	759116
Folded Capillary Cell	Malvern Instruments, Ltd.	DTS1070
Forceps	Shimizu Akira Inc.	Stainless pincet 150
Homogenization Pestle	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuge	Beckman Coulter	BKA46472
Microplate Reader	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Microscope Slide	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S011120
Pipette	Eppendorf Research® plus	3120000909
Pipette Tips	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish	AS ONE Corporation	1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit	Promega corporation	E2810
Rhodamine B Isothiocyanate	Sigma-Aldrich Co., LLC.	283924
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Sodium Carbonate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Surgical Blade and Handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap	Musashi Engineering Inc.	NC-3E
Weighing Balance	Sartorius	CPA225D
Zeta Potentiometer	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS