세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
아폽토시스로 죽어가는 세포는 또한 인접 생균의 기능에 영향을 할 수 있도록 다수의 새로운 작업을 취득로 규제 세포 사멸 함. 이러한 생존, 증식, 성장, 분화 등의 생명 활동은 세포 사멸 세포에 의해 변조 된 많은 세포 기능 중입니다. 사멸 세포에 인식하고 반응하는 능력에 관계없이 혈통 또는 발신의 기관의 모든 세포의 보편적 인 기능이 나타납니다. 그러나, 다이버 시티가 큰 치료 특정 결과에 대한 책임이있는 신호 전달 사건 경로 해부 취해질 사멸 세포의 위임에 대한 응답의 복잡성. 특히, 하나의 세포 자멸사를 포함한 가능한 응답자 세포 내에서 세포 내 신호 전달 경로에 영향을 줄 수있는 다수의 메카니즘을 구별해야의 수용체 – 매개 세포 사멸 세포의 인식은 사멸 세포에 의한 수용성 매개체의 방출 및 / 또는 결합 phagocytic 기계. 여기서, 우리는 세포 사멸에 대한 노출 다음 가능한 응답자 세포에서 유도되는 세포 내 신호 이벤트를 식별하기위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜의 주요 장점은 사멸 세포가 반응 셀 내의 이벤트 신호 조절하는 메커니즘의 절개로 지불주의에 달려있다. 프로토콜을 조건 적 불사 마우스 신장 근위 관상 세포주 (BU.MPT 세포)에 대한 특정하지만, 그것은 쉽게 기원 비상피 및 / 또는 신장 이외의 기관에서 유래 된 세포주에 적용된다. 자극 죽은 세포의 사용은 세포 내 신호 이벤트의 검출을 방해 할 수있는 몇 가지 독특한 요소를 도입한다. 이런 문제뿐만 아니라, 그것들을 최소화하거나 회피 전략이 프로토콜 내에서 설명된다. 이 프로토콜의 적용은 건강과 disea에 모두 죽었거나 죽어가는 세포가 라이브 이웃에 미치는 광범위한 영향의 우리의 확장 지식을 도움한다그 자체.
Introduction
아폽토시스 또는 조절 된 세포 사멸 (1)는, 조직 유지 및 발달에 필수적인 방식으로 기여한다. 가장 간단하게 조회, 세포 사멸의 허가, 세 손상, 또는 과잉 세포는 주변 조직 2,3에 해없이 제거 할 수 있습니다. 조직의 항상성에 세포 사멸의 기여는하지만, 훨씬 더 역동적이고 다양합니다. 아폽토시스로 죽어가는 세포는 여러 새로운 활동을 취득 모두 분비 세포 연관된 인접 생균 4-10의 기능에 영향을 할 수 있도록. 11-16 염증을 억제하기 사멸 세포의 기능에 중점을 이전 연구하지만 사멸 세포는 생존 4,9,10, 4,9,10 증식, 분화 (17)와 같은 중요한 작업을 포함한 세포 기능의 넓은 범위를 조절 이전 18과 성장 19. 더욱이, 이러한 효과는 대 식세포와 같은 전문 식세포에 한정되지S 있지만, 이러한 상피 및 내피 세포 7,9,10,18-21 같은 비 전통적 식세포 비롯한 거의 모든 세포 유형 및 계통으로 연장된다.
사멸 세포에 노출 된 다음 인접 살아있는 세포의 특정 응답은 가능한 응답 세포와 세포 사멸 세포 자체에 모두 관련된 여러 요인에 따라 달라집니다. 사멸 세포에 노출 모두 뮤린 대 식세포 및 신장 근위 관 상피 세포 (PTECs)의 증식을 억제하지만, 예를 들어,이 두 종류의 세포가 사멸 세포 4,6,9,10 그들의 생존 응답 대폭 다르다. 사멸 세포는 대 식세포의 생존을 촉진하지만, PTECs 4,6,9,10의 세포 사멸 죽음을 유도한다. 특히, 세포 사멸에 대한 응답은, 동일한 혈통의 세포 응답을 원점 (10) (유방 상피 비교 예 신장 PTECs의 셀의 응답에 따라 장기 사이에도 다를 수도세포) 또는 활성화 상태 (22) (예, 호중구). 반대로, 사멸 세포는 세포 사멸의 특성에 따라 매우 동일한 셀에서 다른 응답 10,23 또는 10,14 아폽토시스의 스테이지 자극 보여주고있다.
사멸 세포에 대한 반응의 복잡성 · 다양 주어 큰 관심이 특정 결과에 대한 책임이있는 신호 전달 사건 경로 해부에주의해야한다. 첫째, 생존과 사멸 세포 사이의 직접적인 물리적 상호 작용을 필요로하는 응답은 사멸 세포 3,6-10에 의해 발표 또는 생성 된 수용성 매개체에 의해 유도하는 차별화해야합니다. 물리적 상호 작용이 필요한 경우, 추가의 미분이 수행되어야한다. 신호 이벤트는 사멸 세포를 결합하는 특정 수용체의 독립 이후 말림의 독립, 또는 식세포 흡수에 세포 사멸 세포의 수용체 매개 인식에 따라 달라질 수 있습니다 3-7,9,10,19. 후자의 경우에, 응답은 사멸 세포에 고유하지 않으며, 어떠한 재료 식세포 4,6- 의해 트리거 될 수있다.
이 차이의 중요성은 다시 식세포 신장 PTECs의 반응을 대조함으로써 알 수있다. 두 세포 유형의 세포 사멸에 노출 친 생존 키나아제의 Akt의 활성을 변화시킨다. 변조는 0.4 μm의 폴리 카보네이트 막에 의한 응답의 분리 및 세포 사멸 세포 때문에 응답 4,9,10,19를 폐지, 물리적 상호 작용에 따라 달라집니다. 대 식세포의 탐식 4,9,10,19 응답하여 구동하는 반면, PTECs의 반응은 수용체 매개 식균 작용과는 독립적이다. 이러한 결론은 라텍스 비즈 중성 식세포 자극에 노출 더 PTECs에서의 Akt 활성에 효과가 있지만, 흉내 4,9 식세포의 세포 사멸 효과가 없다는 사실에 의해 강화된다.
"덜 연구>하지만, 괴사 또는 우발적 인 세포 사멸 (1)에 의해 죽는 세포는 또한 세포 자멸사 마찬가지로 괴사 세포는 다양한 메커니즘, 특히 누설을 통해 그 효과를 발휘한다. 3-10,19 근처 생존 세포의 기능을 조절 자신의 파열 세포막 3,5,6,9,24을 통해 세포 내 내용의. PTECs 및 대 식세포를 포함한 많은 세포, 세포 괴사 5,9에 의해 죽음에 대해서는 다른 비 경쟁 수용체를 가지고있다. 이러한 수용체의 참여는 신호 이벤트를 유도 세포 사멸 세포가 인산화 9,10,19을 감소하는 반면 자주 사멸 세포 4-10,19에 대한 수용체의 결합에 의해 유도 된 그 반대. 예를 들어, PTECs에서 괴사 세포의 Akt의 인산화를 증가시킨다.여기서는 인접 PTECs 사멸 수용체 – 매개를 통해 인식 가능한 신장 PTECs에 의한 세포 내 신호 이벤트를 식별하기위한 프로토콜을 묘사 <sup> 9,10,19. 프로토콜 BU.MPT 세포 9,10,19,25,26를 알려진 조건 PTEC 불멸화 세포주에 특이하지만, 쉽게 기원 비상피 및 / 또는 이외의 기관에서 유래 된 세포주에 적응 신장. 중요한 세포 자극 등의 사멸 세포의 사용은 수용성 리간드없는 특정 고유 실험 어려움 포즈. 이들 중 가장 중요한 것은 사멸 세포는 현탁액보다는 용액으로 추가되어야한다는 것이다. 이러한 어려움뿐만 아니라, 그것들을 최소화하거나 회피 전략이 프로토콜 내에서 설명된다. 거의 프로토콜에 설명 된 모든 기술은 간단하고, 세포 배양에 대한 표준이다. 이 프로토콜의 장점은 사멸 세포 응답 세포 내 신호 전달을 조절하는 여러 메커니즘의 관심에있다. 이러한 메커니즘은 표면의 결정을 통해 결합 또는 재에 특정 수용체 분자를 브리징 포함sponding 세포 용해성 매개자의 방출, 및 / 또는 식세포 기계 결합. 괴사 세포 결과는 세포 죽음의 모드, 그리고 죽은 세포에 대한 일반화 된 응답에 해당하는지 확인하기 위해 모든 실험에 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에서 권장하는주의 깊은 접근 방식은, 죽어가는 세포가 건강과 질병 모두에서, 라이브 이웃에 발휘 적 확대 영향에 대한 우리의 이해에 중요하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기서 사멸 또는 세포 사멸의 다른 형태를받은 세포에 노출을 다음 생존 세포에서 유도 된 세포 내 신호 이벤트를 특성화하기위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜은 세포 사멸에 대한 노출은 가능한 응답자 세포 내에서 세포 내 신호 전달 경로를 변조 할 수있는 복수의 메커니즘을 강조한다. 이러한 메커니즘은 다음과 같습니다 상호 작용을 (죽은 세포 또는 창고 소포 및 마이크로 소포?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
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