隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
アポトーシスによって死細胞は、隣接する生細胞の機能に影響を与えることを可能に複数の新たな活動を取得し、調整された細胞死と呼ばれます。このような生存、増殖、成長、および分化などの生命活動は、アポトーシス細胞によって変調された多くの細胞機能の一つです。認識し、アポトーシス細胞に応答する能力にかかわらず、発信の系統または器官の、すべてのセルの普遍的な特徴であるように思われます。しかし、細心の注意が任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に取られるアポトーシス細胞の義務に対する応答の多様性と複雑さ。特に、1はアポトーシス細胞を含む、実行可能な応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路に影響を与えることが可能な複数のメカニズムを区別する必要がありますの受容体媒介アポトーシス細胞の認識、アポトーシス細胞による可溶性メディエーターの放出、および/または婚約をphagocytic機械。ここでは、アポトーシス細胞への曝露後の生存可能な応答細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを提供します。プロトコルの主な利点は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達事象を調節するメカニズムの解剖に支払う注意にあります。プロトコルは、条件付きで不死化したマウスの腎臓近位尿細管細胞株（BU.MPT細胞）に特異的であるが、それは容易に原点非上皮細胞および/または腎臓以外の臓器に由来する細胞系に適合されます。刺激として死んだ細胞の使用は、細胞内シグナル伝達事象の検出を妨げることができますいくつかのユニークな要素を紹介します。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。このプロトコルの適用は健康にし、diseaの両方で、死亡または瀕死の細胞は、それらのライブの隣人に及ぼす幅広い影響の私達の拡大の知識を支援する必要がありSE。
Introduction
アポトーシス、または規制された細胞死1は 、組織の維持・発展に不可欠な方法で貢献しています。最も単純に見ると、アポトーシスが損傷し、高齢者許可、または過剰な細胞が組織2,3の周囲に害を及ぼすことなく排除されます。組織ホメオスタシスに対するアポトーシスの寄与は、しかしながら、かなり動的で変化します。アポトーシスによる死細胞は、複数の新たな活動を取得し、両方の分泌され、細胞関連、隣接する生きた細胞4-10の機能に影響を与えるために、それらを可能にします。以前の研究は、炎症11-16を抑制するために、アポトーシス細胞の能力に焦点を当てたが、アポトーシス細胞はまた、生存4,9,10、増殖4,9,10、分化17、などの重要な活動を含む細胞機能の広い範囲を調節しますマイグレーション18、および成長19。また、これらの効果は、マクロファージのような専門の食細胞に限定されるものではありませんsの、そのような上皮および内皮細胞7,9,10,18-21として伝統的に非食細胞を含む、実質的にすべての細胞型および系統、にまで及びます。
アポトーシス細胞への曝露後に隣接する生きた細胞の特異的な応答は、生存応答細胞およびアポトーシス細胞自体の両方に関連する複数の要因に依存します。アポトーシス細胞への曝露は、マウスマクロファージおよび腎臓の近位尿細管上皮細胞（PTECs）の両方の増殖を阻害するが、例えば、これら2つの細胞型は、アポトーシス細胞4,6,9,10に対する生存応答に劇的に異なります。アポトーシス細胞は、マクロファージの生存を促進するが、PTECs 4,6,9,10のアポトーシス死を誘導します。特に、アポトーシス細胞に対する応答は、乳房上皮対 例えば 、腎臓PTECs（起源10の応答細胞の器官に応じて、同じであっても系統の応答細胞の間で異なる場合があります細胞）または活性化22の状態（ 例えば 、好中球）。逆に、アポトーシス細胞は、アポトーシス10,23またはアポトーシス10,14のステージを刺激の性質に依存して全く同じセル内の異なる応答を誘発することができます。
アポトーシス細胞に対する応答の多様性と複雑さを考えると、細心の注意は、任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に注意しなければなりません。まず、生存可能とアポトーシス細胞との間の直接的な物理的相互作用を必要とする回答は、アポトーシス細胞3,6-10によって放出されたか、生成された可溶性メディエーターによって誘発されるものと区別されなければなりません。物理的な相互作用が必要な場合は、さらなる分化が行われるべきです。シグナル伝達事象は、アポトーシス細胞に特異的に結合する特異的受容体とは無関係に、その後の飲み込みの独立したアポトーシス細胞の受容体媒介認識、上、または貪食取り込みに依存してもよいです 3-7,9,10,19。後者の場合、応答は、アポトーシス細胞に特異的ではなく、任意の食作用物質4,6によってトリガすることができます。
これらの区別の重要性は、再びマクロファージおよび腎臓PTECsの応答を対比することによって理解することができます。両方の細胞型のために、アポトーシス細胞への暴露は、プロ生存キナーゼAktの活性を変化させます。 0.4μmのポリカーボネート膜により応答とアポトーシス細胞の分離が応答4,9,10,19を廃止するので変調は、物理的な相互作用に依存しています。マクロファージの応答は貪食4,9,10,19によって駆動されるのに対し、しかし、PTECsの応答は、受容体媒介および食作用とは無関係です。この結論は、ラテックスビーズ、中性食作用の刺激への曝露は、PTECsにおけるAkt活性に影響を及ぼさないという事実が、模倣マクロファージ4,9におけるアポトーシス細胞の効果によって強化されます。
">あまり研究が、壊死により死細胞、または偶発的な細胞死1、また3-10,19近くの生細胞の機能を調節する。アポトーシス細胞と同様に、壊死細胞は、様々なメカニズム、特に漏れを介してその効果を発揮しますその破裂し、細胞膜3,5,6,9,24を介して細胞内のコンテンツの。PTECsおよびマクロファージを含む多くの細胞は、壊死5,9により死細胞のための明確な非競合受容体を有する。これらの受容体の婚約があるシグナリング事象を誘発しますアポトーシス細胞は、リン酸化9,10,19を減少させる一方、アポトーシス細胞の受容体4-10,19の係合によって誘発されたものとしばしば反対。例えば、PTECsに、壊死細胞は、Aktのリン酸化を増加させます。ここでは、隣接するアポトーシスPTECsの受容体媒介性の認識によって実行可能な腎臓PTECsに誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを記述します<sup> 9,10,19。プロトコルはBU.MPT細胞9,10,19,25,26のように知られている条件付きで不死化PTECの細胞株に特異的であるが、それは容易に原点非上皮および/または以外の臓器に由来する細胞系に適合されています腎臓。重要なことには、細胞刺激などのアポトーシス細胞の使用は、可溶性リガンドと共に存在しない特定の固有の実験的な困難をもたらします。これらの中で最も重要なのは、アポトーシス細胞を懸濁液としてではなく、溶液として添加されなければならないということです。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。ほとんどのプロトコルに記載された技術のすべては、簡単で、細胞培養の標準です。このプロトコルの利点は、アポトーシス細胞が応答して細胞内のシグナル伝達を調節することにより、複数のメカニズムに注目です。これらのメカニズムは、表面決定を経由して結合または再上の特定の受容体に架橋分子が含まsponding細胞、可溶性メディエーターの放出、および/または食作用機械の締結。壊死細胞は、結果は、細胞死のモードではなく、死細胞に一般的な応答に特異的であることを保証するために、すべての実験に含まれています。このプロトコルで推奨されているように慎重なアプローチは、死にかけている細胞は、健康と病気の両方で、彼らのライブの隣人に及ぼす拡大を続ける影響の理解に重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、アポトーシスまたは細胞死の他の形態を経ている細胞への曝露後の生存細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を特徴づけるためのプロトコルを提供します。プロトコルは、アポトーシス細胞の曝露は、生存応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路を調節することが可能な複数の機構を強調しています。これらのメカニズムは、次のとおりです。対話を（死んだ細胞またはその小?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
