تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
الخلايا الميتة التي كتبها موت الخلايا المبرمج، وأشار أيضا إلى موت الخلايا كما ينظم، والحصول على أنشطة جديدة متعددة تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة. الأنشطة الحيوية، مثل البقاء على قيد الحياة، وانتشار والنمو والتمايز، هي من بين العديد من الوظائف الخلوية عن طريق التضمين خلايا أفكارك. تظهر القدرة على التعرف والرد على الخلايا أفكارك لتكون سمة عالمية لجميع الخلايا، بغض النظر عن النسب أو الجهاز من الأصل. ومع ذلك، فإن تنوع وتعقيد استجابة للولايات خلايا أفكارك باتخاذ عناية كبيرة في تشريح أحداث ومسارات إشارات مسؤولة عن أي نتيجة معينة. على وجه الخصوص، لا بد من التمييز بين آليات متعددة من الخلايا التي أفكارك يمكن أن تؤثر في مسارات الإشارات بين الخلايا داخل الخلايا المستجيب قابلة للحياة، بما في ذلك: الاعتراف بوساطة مستقبلات الخلية أفكارك، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان من قبل الخلية أفكارك، و / أو إشراك phagoماكينات إختر التصميم. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتحديد أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في خلايا المستجيب قابلة للحياة بعد تعرضهم للخلايا أفكارك. والميزة الرئيسية لبروتوكول تكمن في الاهتمام الذي يدفع إلى تشريح الآلية التي الخلايا أفكارك تعدل إشارات الأحداث داخل الخلايا الاستجابة. في حين أن البروتوكول هو محدد للحصول على خط خلد مشروط الماوس الكلى القريبة خلية أنبوبي (خلايا BU.MPT)، أنها تتكيف بسهولة مع خطوط الخلايا التي هي غير الظهارية في المنشأ و / أو مشتقة من الأجهزة الأخرى من الكلى. استخدام الخلايا الميتة كحافز يقدم العديد من العوامل الفريدة التي يمكن أن تعيق الكشف عن أحداث الإشارات بين الخلايا. هذه المشاكل، وكذلك استراتيجيات لتقليل أو الالتفاف عليها، ومناقشتها في البروتوكول. تطبيق هذا البروتوكول يجب أن تساعد معرفتنا توسيع نفوذ واسع على أن الخلايا الميتة أو التي تحتضر تمارس على جيرانهم الحية، سواء في مجال الصحة وفي diseaحد ذاتها.
Introduction
موت الخلايا المبرمج، أو ينظم موت الخلية 1، يساهم بطريقة ضرورية لصيانة وتطوير الأنسجة. ينظر معظم ببساطة، تصاريح موت الخلايا المبرمج الذين تتراوح أعمارهم بين، التالفة، أو الخلايا الزائدة ليتم التخلص منها دون ضرر للأنسجة المحيطة 2،3. مساهمة من موت الخلايا المبرمج للتوازن الأنسجة، مع ذلك، إلى حد كبير أكثر ديناميكية ومتنوعة. الخلايا الميتة بواسطة الخلايا تكتسب أنشطة جديدة متعددة، سواء يفرز والخلايا المرتبطة، والتي تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة 4-10. الدراسات السابقة ركزت على قدرة خلايا أفكارك لقمع التهاب 11-16، ولكن الخلايا أفكارك أيضا تعدل مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك أنشطة حيوية مثل بقاء 4،9،10، وانتشار 4،9،10، والتمايز 17، الهجرة 18، والنمو 19. وعلاوة على ذلك، لا تقتصر هذه الآثار على البالعات المهنية، مثل بلعمالصورة، بل تمتد إلى جميع أنواع وسلالات الخلايا تقريبا، بما في ذلك الخلايا عادة غير البلعمية، مثل الظهارية والخلايا البطانية 7،9،10،18-21.
استجابة محددة من الخلايا الحية المجاورة بعد التعرض لخلايا أفكارك تعتمد على عوامل متعددة تتعلق كلا من خلايا الاستجابة وقابلة للحياة الخلايا أفكارك أنفسهم. على سبيل المثال، على الرغم من أن التعرض للخلايا أفكارك يمنع انتشار كل الضامة الفئران والكلى القريبة الخلايا الظهارية أنبوبي (PTECs)، وهذه أنواع الخلايا اثنين تختلف بشكل كبير في استجابة بقائهم على قيد الحياة لخلايا أفكارك 4،6،9،10. خلايا أفكارك تعزيز بقاء الضامة، ولكن تحفز وفاة أفكارك من PTECs 4،6،9،10. تجدر الإشارة إلى أن استجابة لخلايا أفكارك قد تختلف حتى بين الاستجابة خلايا من نفس النسب، اعتمادا على الجهاز الخلية المجيب من أصل 10 (على سبيل المثال، PTECs الكلى مقابل الظهارية الثدييةخلايا) أو حالة تفعيل 22 (على سبيل المثال، العدلات). على العكس، قد الخلايا أفكارك تثير استجابات مختلفة في نفس الخلية تبعا لطبيعة أفكارك التحفيز 10،23 أو مرحلة موت الخلايا المبرمج 10،14.
ونظرا لdiverseness وتعقيد ردا على الخلايا أفكارك، يجب توخي الحرص الشديد في تشريح أحداث ومسارات إشارات مسؤولة عن أي نتيجة معينة. أولا، والاستجابات التي تتطلب التفاعل المادي المباشر بين خلايا قابلة للحياة وأفكارك يجب تفريقها عن تلك التي تسببها وسطاء للذوبان صدر أو الناتجة عن الخلية أفكارك 3،6-10. إذا كان مطلوبا التفاعل الجسدي، ثم تمايز مزيد من يجب أن يتم تنفيذ. قد تعتمد يشير الأحداث على الاعتراف بوساطة مستقبلات الخلية أفكارك، بغض النظر عن ابتلاع لاحقة، أو على امتصاص أكلة، مستقلة عن مستقبلات معينة التي تربط الخلية أفكارك 3-7،9،10،19. في الحالة الأخيرة، فإن الاستجابة ليست محددة لخلايا أفكارك، ويمكن أن تنجم عن أي مواد أكلة 4،6.
أهمية هذه الفروق يمكن مرة أخرى موضع تقدير من قبل المتناقضة ردود الضامة وPTECs الكلى. لكل أنواع الخلايا، والتعرض للخلايا أفكارك يغير من نشاط كيناز المؤيدة للبقاء AKT. تعديل يعتمد على التفاعل المادي، لأن الفصل بين الاستجابة والخلايا أفكارك عن طريق غشاء البولي 0.4 ميكرون يلغي استجابة 4،9،10،19. ومع ذلك، فإن رد PTECs هي مستقبلات بوساطة ومستقلة البلعمة، بينما هو الدافع وراء رد الضامة التي كتبها البلعمة 4،9،10،19. ومما يعزز هذا الاستنتاج من خلال حقيقة أن التعرض لحبات اللاتكس، حافزا أكلة محايد، ليس له أي تأثير على النشاط AKT في PTECs، ولكن يقلد تأثير خلايا أفكارك في الضامة 4،9.
"> وعلى الرغم من دراستها بشكل أقل، الخلايا الميتة التي نخر، أو عرضي موت الخلايا 1، كما تعدل وظيفة خلايا قابلة للحياة في مكان قريب 3-10،19. مثل الخلايا أفكارك، والخلايا الميتة تمارس تأثيرها من خلال مجموعة متنوعة من الآليات، ولا سيما تسرب محتويات الخلايا من خلال من تمزق غشاء الخلية 3،5،6،9،24. العديد من الخلايا، بما في ذلك PTECs والضامة، تمتلك مستقبلات غير منافسة متميزة للالخلايا الميتة التي تنخر 5،9. إشراك هذه المستقبلات يحرض يشير الأحداث التي في كثير من الأحيان عكس تلك الناجمة عن إشراك مستقبلات الخلايا أفكارك 4-10،19. على سبيل المثال، في PTECs، والخلايا الميتة زيادة الفسفرة من AKT، في حين أن انخفاض خلايا أفكارك الفسفرة 9،10،19.هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في PTECs الكلى قابلة للحياة من خلال الاعتراف بوساطة مستقبلات PTECs أفكارك المجاورة <sup> 9،10،19. في حين أن البروتوكول هو محدد لخط الخلية PTEC خلد مشروط المعروفة باسم خلايا BU.MPT 9،10،19،25،26، أنها تتكيف بسهولة مع خطوط الخلايا التي هي غير الظهارية في المنشأ و / أو مشتقة من الأجهزة الأخرى من الكلى. الأهم من ذلك أن استخدام الخلايا أفكارك كحافز خلية يطرح بعض الصعوبات التجريبية الأصيلة غير موجودة مع بروابط القابلة للذوبان. وأهم هذه العناصر هو أن الخلايا أفكارك يجب إضافة وتعليق بدلا من أن تكون حلا. هذه الصعوبات، وكذلك استراتيجيات لتقليل أو الالتفاف عليها، ومناقشتها في البروتوكول. تقريبا كل الأساليب المذكورة في البروتوكول هي واضحة وموحدة لزراعة الخلايا. وميزة هذا البروتوكول تكمن في اهتمامها إلى آليات متعددة من الخلايا التي أفكارك تعدل نقل الإشارة داخل الخلايا الاستجابة. وتشمل هذه الآليات الربط عبر محددات السطح أو سد الجزيئات لمستقبلات معينة على إعادةsponding الخلية، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان، و / أو إشراك آلية البلعمة. يتم تضمين الخلايا الميتة في جميع التجارب للتأكد من أن النتائج هي محددة لطريقة موت الخلايا، وليس استجابة تعميمها على الخلايا الميتة. نهج دقيق، على النحو الموصى به في هذا البروتوكول، أمر بالغ الأهمية في فهمنا لتأثير توسيع أي وقت مضى أن الخلايا الميتة تمارس على جيرانهم الحية، سواء في الصحة والمرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن نقدم هنا بروتوكول لوصف أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في خلايا قابلة للحياة بعد تعرضها لالخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج، أو غيرها من موت الخلايا الأشكال. ويؤكد البروتوكول على آليات متعددة التي التعرض للخلايا أفكارك يمكن أن تعدل مسارات الإشارات بي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
