Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Summary

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Abstract

Les cellules meurent par apoptose, également appelé mort cellulaire comme réglementé, acquérir plusieurs nouvelles activités qui leur permettent d'influencer la fonction des cellules vivantes adjacentes. activités vitales, comme la survie, la prolifération, la croissance et la différenciation, sont parmi les nombreuses fonctions cellulaires modulées par les cellules apoptotiques. La capacité de reconnaître et de répondre à des cellules apoptotiques semble être une caractéristique universelle de toutes les cellules, indépendamment de la lignée ou de l'organe d'origine. Toutefois, la diversité et la complexité de la réponse à des cellules apoptotiques mandats qu'un grand soin soit pris en disséquant les événements de signalisation et les voies responsables de tout résultat particulier. En particulier, il faut distinguer entre les multiples mécanismes par lesquels les cellules apoptotiques peuvent influer sur les voies de signalisation intracellulaire dans les cellules répondeuses viables, comprenant: la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, la libération de médiateurs solubles par les cellules apoptotiques et / ou de l'engagement de la phagomachines cytic. Ici, nous fournissons un protocole permettant d'identifier les événements de signalisation intracellulaires qui sont induits dans les cellules répondeuses viables après leur exposition à des cellules apoptotiques. Un avantage majeur du protocole réside dans l'attention qu'il porte à la dissection du mécanisme par lequel les cellules apoptotiques modulent des événements dans les cellules répondant de signalisation. Bien que le protocole est spécifique d'une lignée conditionnellement immortalisée de rein de souris proximale de la cellule tubulaire (cellules BU.MPT), elle est facilement adaptable à des lignées cellulaires qui ne sont pas d'origine épithéliale et / ou dérivés d'organes autres que le rein. L'utilisation de cellules mortes comme un stimulus introduit plusieurs facteurs uniques qui peuvent nuire à la détection d'événements de signalisation intracellulaires. Ces problèmes, ainsi que des stratégies visant à minimiser ou les contourner, sont discutés dans le protocole. L'application de ce protocole devrait aider notre connaissance croissante de la grande influence que les cellules mortes ou mourantes exercent sur leurs voisins en direct, à la fois dans la santé et dans diseÃproprement parler.

Introduction

Apoptose, ou réglementé la mort cellulaire ^1, contribue de manière essentielle à l'entretien et le développement des tissus. Vu la plus simple, permet d'apoptose âgés, endommagées, ou les cellules excédentaires à éliminer sans nuire aux tissus environnants ^2,3. La contribution de l'apoptose à l'homéostasie tissulaire, cependant, est nettement plus dynamique et varié. Les cellules meurent par apoptose acquièrent plusieurs nouvelles activités, à la fois sécrétée et associée aux cellules, qui leur permettent d'influencer la fonction des cellules vivantes adjacentes ^4-10. Des études antérieures ont porté sur la capacité des cellules apoptotiques pour supprimer l' inflammation ^11-16, mais les cellules apoptotiques modulent également une large gamme de fonctions cellulaires, y compris des activités vitales comme la survie ^4,9,10, la prolifération ^4,9,10, la différenciation ^17, migration ^18, et la croissance ^19. De plus, ces effets ne sont pas limités aux phagocytes professionnels, comme macrophages, mais étendre à pratiquement tous les types et les lignées cellulaires, y compris les cellules traditionnellement non phagocytaires, telles que les cellules épithéliales et endothéliales ^{7,9,10,18-21.}

La réponse spécifique des cellules vivantes adjacentes suite à une exposition à des cellules apoptotiques dépend de multiples facteurs qui se rapportent à la fois les cellules répondant viables et les cellules apoptotiques eux-mêmes. Par exemple, bien que l' exposition à des cellules apoptotiques inhibe la prolifération des macrophages murins et les cellules epitheliales tubulaires proximales des reins (PTECs), ces deux types de cellules diffèrent considérablement dans leur réponse à la survie des cellules apoptotiques ^4,6,9,10. Les cellules apoptotiques favorisent la survie des macrophages, mais induisent la mort apoptotique de PTECs ^4,6,9,10. En particulier, la réponse aux cellules apoptotiques peuvent varier , même parmi les cellules répondant de la même lignée, en fonction de l'organe de la cellule de réponse d'origine ¹⁰ (par exemple, PTECs rénaux par rapport à l' épithélium mammairecellules) ou état d'activation ²² (par exemple, les neutrophiles). A l' inverse, les cellules apoptotiques peuvent provoquer des réactions différentes dans la même cellule en fonction de la nature du stimulus apoptotique ^10,23 ou au stade de l' apoptose ^10,14.

Compte tenu de la diverseness et de la complexité de la réponse à des cellules apoptotiques, un grand soin doit être pris à disséquer les événements de signalisation et les voies responsables de tout résultat particulier. Tout d' abord, les réponses nécessitant une interaction physique directe entre les cellules viables et apoptotiques doivent être différenciés de ceux provoqués par les médiateurs solubles libérés ou générés par la cellule apoptotique ^3,6-10. Si une interaction physique est nécessaire, une différenciation supplémentaire doit être effectuée. les événements de signalisation peuvent dépendre de la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, indépendamment de l'engloutissement subséquente ou de l'absorption phagocytaire, indépendamment du récepteur spécifique qui se lie à la cellule apoptotique 3-7,9,10,19. Dans ce dernier cas, la réponse est non spécifique aux cellules apoptotiques, et peut être déclenchée par n'importe quel matériau phagocytaire ^4,6.

L'importance de ces différences peut à nouveau être appréciée en comparant les réponses des macrophages et PTECs rénaux. Pour les deux types de cellules, l'exposition à des cellules apoptotiques modifie l'activité de la pro-survie kinase Akt. La modulation dépend de l' interaction physique, étant donné que la séparation des cellules apoptotiques et de répondre par une membrane de polycarbonate de 0,4 um supprime la réponse ^4,9,10,19. Cependant, la réponse de PTECs est médiée par un récepteur indépendant de la phagocytose, alors que la réponse des macrophages est entraînée par phagocytose ^4,9,10,19. Cette conclusion est renforcée par le fait que l' exposition à des billes de latex, un stimulus phagocytaire neutre, n'a pas d' effet sur l' activité Akt dans PTECs, mais imite l'effet des cellules apoptotiques dans les macrophages ^4,9.

"> Bien que moins bien étudié, les cellules meurent par nécrose ou mort accidentelle de la cellule ^1, modulent également la fonction des cellules à proximité viables ^3-10,19. Comme les cellules apoptotiques, les cellules nécrotiques exercent leurs effets à travers une variété de mécanismes, notamment la fuite du contenu intracellulaire à travers leur membrane cellulaire rupture ^3,5,6,9,24. de nombreuses cellules, y compris les PTECs et les macrophages, possèdent des récepteurs distincts non concurrentes pour les cellules meurent par une nécrose de ^5,9. l' engagement de ces récepteurs induit des événements de signalisation qui sont souvent opposés à ceux induits par l' engagement des récepteurs des cellules apoptotiques ^4-10,19. par exemple, dans PTECs, les cellules nécrotiques augmentent la phosphorylation de Akt, tandis que les cellules apoptotiques diminue la phosphorylation ^9,10,19.

Ici, nous décrivons un protocole pour identifier les événements de signalisation intracellulaires induits dans PTECs rénaux viables par la reconnaissance médiée par le récepteur des PTECs adjacents apoptotiques <sup> 9,10,19. Bien que le protocole est spécifique à une lignée cellulaire immortalisée de manière conditionnelle PTEC appelées cellules BU.MPT ^{9,10,19,25,26,} elle est facilement adaptable à des lignées cellulaires qui ne sont pas d'origine épithéliale et / ou dérivés d'autres organes que le rein. Surtout, l'utilisation de cellules apoptotiques comme un stimulant de cellules pose certaines difficultés expérimentales intrinsèques ne sont pas présents avec des ligands solubles. Le plus important est que les cellules apoptotiques doivent être ajoutés sous forme d'une suspension plutôt que comme une solution. Ces difficultés, ainsi que des stratégies visant à minimiser ou les contourner, sont discutés dans le protocole. Presque toutes les techniques décrites dans le protocole sont simples et standard pour la culture cellulaire. L'avantage de ce protocole réside dans son attention sur les multiples mécanismes par lesquels les cellules apoptotiques modulent la transduction du signal dans les cellules répondantes. Ces mécanismes comprennent la liaison par l'intermédiaire des déterminants de surface ou des molécules de pontage à des récepteurs spécifiques sur la repondant cellulaire, la libération de médiateurs solubles et / ou de l'engagement du mécanisme phagocytaire. Les cellules nécrotiques sont incluses dans toutes les expériences pour faire en sorte que les résultats sont spécifiques au mode de mort cellulaire, et non une réaction généralisée aux cellules mortes. Une approche prudente, comme il est recommandé dans ce protocole, est essentielle à notre compréhension de l'influence toujours croissante que les cellules qui meurent exercent sur leurs voisins en direct, à la fois la santé et de la maladie.

Protocol

1. Préparatifs Remarque: Dans ce protocole, deux ou plusieurs lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires, sont préparés indépendamment dans des conditions spécifiques. Ces préparations comprennent des cellules apoptotiques (Protocole 1), les cellules nécrotiques (protocole 2), et les cellules de répondeur en bonne santé (protocole 3). Après la préparation indépendante des cellules apoptotiques ou nécrotiques sont ajoutées aux cellules répondeuses et de la transdu…

Representative Results

Dans la figure 1, nous fournissons un schéma représentant les timing et critiques étapes impliquées dans la préparation de cellules apoptotiques (Protocole 1) et les cellules nécrotiques (protocole 2) et la stimulation des cellules de répondeur avec des suspensions de cellules apoptotiques et nécrotiques (protocole n ° 4). Sur la figure 2, nous fournissons des résultats représentati…

Discussion

Nous fournissons ici un protocole permettant de caractériser les événements de signalisation intracellulaires induits dans les cellules viables suite à leur exposition à des cellules subissant une apoptose ou d'autres formes de mort cellulaire. Le protocole met l'accent sur les multiples mécanismes par lesquels l'exposition à des cellules apoptotiques peuvent moduler les voies de signalisation intracellulaire dans les cellules répondeuses viables. Ces mécanismes sont les suivants: l'interaction …

Materials

Cell culture materials
DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate	Mediatech (Manassas, VA)	10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum	GE Healthcare (Logan, UT)	SH30066.03	add 10% (v/v)  to the culture medium A
Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X	Life Technologies (Grand Island, NY)	10378-016	add 100 units/mL to the culture media A and B
γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli	Calbiochem, Millipore (Billerica, MA)	407303	add 10 units/mL to the culture medium A
Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic	Corning (Durham, NC)	353003	sterile, 100 mm diameter
Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom	Corning (Durham, NC)	352095	sterile, 15 mL
Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco	Fisher (Waltham, MA)	25300062	sterile, 100 mL
Name	Company	Catalog	Comments
Chemicals and inhibitors
Staurosporine, from Streptomyces sp.	Sigma (St. Louis, MO)	S4400	use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis
Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml]	Millipore (Billerica, MA)	EA140	use at 50 nM to stimulate responder cells
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies (Grand Island, NY)	15575-038	use 5 mM to detach adherent cells
Trypan blue solution, 0.4%	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	91691049	for dead cells staining
Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS	Affymetrix (Santa Clara, CA)	19943	use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco	Life Technologies (Grand Island, NY)	14040133	stock solution
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco	Life Technologies (Grand Island, NY)	14190367	stock solution
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii	Sigma (St. Louis, MO)	C8273	use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma (St. Louis, MO)	D2650	solvent for cytochalasin D
Name	Company	Catalog	Comments
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4	BioRad (Hercules, CA)	1706435	for cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	221368	10 mM for cell lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	D6750	0.5% w/v for cell lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	L3771	0.1% w/v for cell lysis buffer
Glycerol	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	G5516	10% for cell lysis buffer
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	450022	25 mM for cell lysis buffer
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet	Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)	4693159001	for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T8787	10% for cell lysis buffer
Dithiothreitol (DTT)	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	11DTT00005	1 mM for cell lysis buffer
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	4800263	1 mM for cell lysis buffer
Sodium orthovandate	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	2159664	10 mM for cell lysis buffer
Name	Company	Catalog	Comments
Equipment
Sorvall T6000B centrifuge	Du Pont (Wilmington, DE)	T6000B
Fisher Tissuemat, water bath	Fisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100	Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber, Neubauer	Hawksley (Lancing, Sussex, UK)	AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II	Millipore (Billerica, MA)	CBA059	for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T9661
Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane	Corning (Corning, NY)	3413	sterile, polystyrene, tissue culture treated
Name	Company	Catalog	Comments
Antibodies
Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody	Cell Signaling Technology	9331	rabbit polyclonal antibody
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) )	Cell Signaling Technology	2118	rabbit monoclonal antibody