זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
תאים מתים על ידי אפופטוזיס, התייחסו גם הוא מוות של תאים מוסדרים, לרכוש פעילויות חדשות מרובות המאפשרות להם להשפיע על התפקוד של תאי חיים סמוכים. פעילויות חיוניות, כגון הישרדות, שגשוג, צמיחה, והבחנה, הן בין התפקודים תאיים הרבים מווסתים על ידי תאים אפופטוטיים. היכולת לזהות ולהגיב תאים אפופטוטיים שנראה תכונה אוניברסלית של כל התאים, מבלי להתחשב בשושלת היוחסין או איבר של המקור. עם זאת, המגוון והמורכבות של בתגובת מנדטי תאים אפופטוטיים כי בזהירות רבה להילקח לשלוף את איתות האירועים ושבילים אחראים לכל תוצאה מסוימת. בפרט, יש להבחין בין מספר מנגנונים שבאמצעותם תאים אפופטוטיים יכול להשפיע מסלולי איתות תאיים בתוך תאים המגיב קיימא, כולל: הכרה בתיווך קולטן של תאים אפופטוטיים, שחרור של מתווכים מסיסים על ידי תאים אפופטוטיים, ו / או מעורבות של phagoמכונה cytic. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי אירועי איתות תאיים כי הם המושרה בתאים המגיבים קיימא הבא חשיפתם תאים אפופטוטיים. יתרון עיקרי של הפרוטוקול טמון התשומה משתלמת דיסקציה של המנגנון שבאמצעותו תאים אפופטוטיים לווסת איתות אירועים בתוך תאים להגיב. בעוד הפרוטוקול ספציפי עבור קו תא צינורי הפרוקסימלי כליות עכבר הונצח על תנאי (תאי BU.MPT), הוא מותאם בקלות שורות תאים שאינן-אפיתל במקורו ו / או נגזרים איברים מלבד הכליה. השימוש של תאים מתים כגירוי מציג מספר גורמים ייחודיים שיכול לעכב את הגילוי של אירועי איתות תאיים. בעיות אלה, כמו גם אסטרטגיות כדי למזער או לעקוף אותם, הם דנו בתוך הפרוטוקול. יישום של פרוטוקול זה אמור לסייע הידע והרחבת שלנו של השפעה רחבה מתים או גוססים תאים להפעיל על השכנים לחיות שלהם, הן בבריאות disease.
Introduction
אפופטוזיס, או מוות של תאי מוסדר 1, תורם באופן מהותי את התחזוקה והפיתוח של רקמות. הנצפים ביותר פשוט, היתרי אפופטוזיס בגילאי, פגומים, או להתבטל תאים עודפים מבלי לפגוע סביב 2,3 רקמות. תרומת אפופטוזיס הומאוסטזיס רקמות, לעומת זאת, היא הרבה יותר דינמית ומגוונת. תאים מתים על ידי אפופטוזיס לרכוש פעילויות חדשות מרובות, הן מופרשות הקשורים תא, אשר מאפשר להם להשפיע על התפקוד של תאי חיים סמוכים 4-10. מחקרים קודמים התמקדו ביכולת של תאים אפופטוטיים לדכא דלקת 11-16, אבל תאים אפופטוטיים גם לווסת מגוון רחב של תפקודים תאיים, כוללים פעילויות חיוניות כגון הישרדות 4,9,10, התפשטות 4,9,10, בידול 17, הגירה 18, והצמיחה 19. יתר על כן, תופעות אלה אינן מוגבלים פגוציטים מקצועיים, כמו מקרופאגים, אבל להאריך כמעט לכל סוגי תאים שושלות, כולל מסורתי שאינו phagocytic תאים, כגון אפיתל ותאי האנדותל 7,9,10,18-21.
התגובה הספציפית של תאי חיים הסמוך בעקבות חשיפת תאי אפופטוטיים תלויה בגורמים מרובים להתייחס לשני התאים להגיב הקיימא ואת תאי אפופטוטיים עצמם. לדוגמה, אם כי חשיפה תאים אפופטוטיים מעכב התפשטות של שניהם מקרופאגים בעכברים ותאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות (PTECs), סוגי תאים שני אלה שונים באופן דרמטי בתגובה ההישרדות שלהם תאים אפופטוטיים 4,6,9,10. תאים אפופטוטיים לקדם את ההישרדות של מקרופאגים, אבל לגרום למותם אפופטוטיים של PTECs 4,6,9,10. יש לציין, כי בתגובת תאים אפופטוטיים עשויה להיות שונה גם בקרב להגיב תאים מאותו השושלת, תלוי האיבר של התא להגיב ממוצא 10 (למשל, כליות PTECs לעומת אפיתל חלבתאים) או מצב הפעלה 22 (למשל, נויטרופילים). לעומת זאת, תאים אפופטוטיים עלולים לעורר תגובות שונות לאותו תא בהתאם לאופי של אפופטוטיים גירוי 10,23 או בשלב של אפופטוזיס 10,14.
בהתחשב diverseness ומורכב בתגובת תאים אפופטוטיים, בזהירות רבה יש לנקוט לנתח את האירועים ואת מסלולי איתות אחראים לכל תוצאה מסוימת. ראשית, תגובות הדורשים אינטראקציה פיזית ישירה בין תאי קיימא אפופטוטיים חייבות להיות מובחנות מאלה שהושרו על ידי מתווכים מסיסים שוחררו או שמופקים על ידי תאי אפופטוטיים 3,6-10. אם אינטראקציה פיזית נדרש, אז בידול נוסף צריך להתבצע. אירועי איתות יכולים להיות תלויים הכרת קולטן בתיווך של התאים אפופטוטיים, העצמאיים של היבלעות עוקבת או על ספיגת phagocytic, העצמאיים של קולטן המסוים שקושר את התאים אפופטוטיים 3-7,9,10,19. במקרה האחרון, התגובה אינה ספציפית תאים אפופטוטיים, והוא יכול להיות מופעל על ידי כל חומר phagocytic 4,6.
חשיבותה של ההבחנות האלה יכול שוב להיות מוערך על ידי מנוגדים התגובות של מקרופאגים PTECs כליות. עבור שני סוגי התאים, חשיפת תאים אפופטוטיים משנה את הפעילות של קינאז פרו-הישרדות Akt. האפנון תלוי אינטראקציה פיזית, מאז פרידה של להגיב תאי אפופטוטיים ידי קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר מבטל את התגובה 4,9,10,19. עם זאת, התגובה של PTECs היא קולטן בתיווך ועצמאי של phagocytosis, ואילו התגובה של מקרופאגים היא מונעת על ידי phagocytosis 4,9,10,19. מסקנה זו מתחזקת לאור העובדה כי חשיפה חרוזים לטקס, גירוי phagocytic נייטרלי, אין כל השפעה על פעילות Akt ב PTECs, אבל מחקה את ההשפעה של תאים אפופטוטיים מקרופאגים 4,9.
"> אמנם פחות טוב למד, תאים מתים על ידי נימק, או מוות של תאי בשוגג 1, גם לווסת את הפונקציה של תאי קיימא הסמוכים 3-10,19. כמו תאים אפופטוטיים, תאי נימקים להשפעות שלהם באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, במיוחד הדליפה תוכן תאיים דרך קרום התא מהקרע שלהם 3,5,6,9,24. תאים רבים, כולל PTECs מקרופאגים, להחזיק קולטנים שאינם מתחרה ברורים עבור תאים מתים על ידי נימק 5,9. אירוסין של קולטנים אלה גורמים אירועי איתות כי הם לעתים קרובות הפוכה לגמרי מזו הנגרמת על ידי מעורבות של קולטנים תאים אפופטוטיים 4-10,19. לדוגמה, ב PTECs, תאים נמקי להגדיל זירחון של Akt, ואילו תאים אפופטוטיים להקטין זירחון 9,10,19.כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי אירועי איתות תאיים מושרים PTECs כליות קיימא באמצעות הכרת קולטן בתיווך של PTECs אפופטוטיים סמוך <sup> 9,10,19. בעוד פרוטוקול ספציפי עבור קו התא PTEC הונצח על תנאי המכונה תאים BU.MPT 9,10,19,25,26, הוא מותאם בקלות שורות תאים שאינן-אפיתל במקורו ו / או נגזר איברים מלבד הכליה. חשוב לציין, שימוש תאי אפופטוטיים כגירוי תא מציב קשיים הניסיונות טמון מסוימים לא מקיימים עם ליגנדים מסיסים. החשוב ביותר של אלה הוא כי תאים אפופטוטיים יש להוסיף כמו השעיה ולא כפתרון. קשיים אלה, כמו גם אסטרטגיות כדי למזער או לעקוף אותם, הם דנו בתוך הפרוטוקול. כמעט כל הטכניקות המתוארות בפרוטוקול הם פשוט תקן תרבית תאים. היתרון של פרוטוקול זה טמון לידיעתה אל מספר מנגנונים שבאמצעותם תאים אפופטוטיים לווסת הולכת אותות בתוך התאים להגיב. מנגנונים אלה כוללים את הכריכה באמצעות גורמי משטח או גישור מולקולות קולטנים ספציפיים על מחדשתא sponding, שחרור מתווכים מסיסים, ו / או ההתקשרות של מכונות phagocytic. תאי נימקים כלולים בכל הניסויים על מנת להבטיח כי תוצאות הן ספציפיות במצב של מוות של תאים, ולא תגובה להכליל את התאים מתים. גישה זהירה, כמומלץ בפרוטוקול זה, הוא קריטי להבנתנו את ההשפעה ההולך ומתרחב כי תאים מתים להפעיל על שכני לחיות שלהם, בשתי בריאות ומחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מספקים כאן פרוטוקול לאפיון אירועי האיתות התאי מושרים תאי קיימא לאחר חשיפתם לתאים העוברים אפופטוזיס, או צורות אחרות של מוות של תאים. הפרוטוקול מדגיש את מספר מנגנונים שבאמצעותם חשיפת תאי אפופטוטיים יכולה לווסת מסלולי איתות תאיים בתוך תאי המגיב קיימא. מנגנונים אלה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
