Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
Le cellule che muoiono per apoptosi, di cui anche la morte delle cellule, come regolamentato, acquisire più nuove attività che consentono loro di influenzare la funzione di cellule vive adiacenti. attività vitali, come la sopravvivenza, la proliferazione, la crescita e la differenziazione, sono tra le molte funzioni cellulari modulati dalle cellule apoptotiche. La capacità di riconoscere e rispondere alle cellule apoptotiche sembra essere una caratteristica universale di tutte le cellule, indipendentemente stirpe o organo dell'origine. Tuttavia, la diversità e la complessità della risposta di cellule apoptotiche mandati che grande cura essere presa in sezionare gli eventi di segnalazione e percorsi responsabili per qualsiasi particolare risultato. In particolare, si deve distinguere tra le molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche possono influenzare vie di segnalazione intracellulare nelle cellule responder vitali, tra cui: il riconoscimento mediata dal recettore della cellula apoptotica, rilascio di mediatori solubili dalla cellula apoptotica, e / o impegno della phagomacchinari cytic. Qui, forniamo un protocollo per identificare gli eventi di segnalazione intracellulare che sono indotti in cellule responder vitali a seguito della loro esposizione a cellule apoptotiche. Uno dei principali vantaggi del protocollo sta nella sua attenzione alla dissezione del meccanismo con cui le cellule apoptotiche modulano la segnalazione di eventi all'interno delle cellule che rispondono. Mentre il protocollo è specifico per una linea condizionale immortalate rene di topo prossimale cella tubolare (cellule BU.MPT), è facilmente adattabile alle linee di cellule che non sono di origine epiteliale e / o derivato da organi diversi dal rene. L'uso di cellule morte come stimolo introduce diversi fattori unici che possono ostacolare la rilevazione di eventi di segnalazione intracellulare. Questi problemi, così come le strategie per ridurre al minimo o evitare loro, sono discusse all'interno del protocollo. L'applicazione di questo protocollo dovrebbe aiutare la nostra conoscenza in espansione della grande influenza che le cellule morte o morenti esercitano sui loro vicini in tempo reale, sia in salute e in DiseaSE.
Introduction
L'apoptosi, o morte cellulare regolamentato 1, contribuisce in modo essenziale al mantenimento e sviluppo dei tessuti. Visto più semplicemente, permette di apoptosi età, danneggiati, o le cellule in eccesso per essere eliminati senza danno ai tessuti circostanti 2,3. Il contributo di apoptosi all'omeostasi del tessuto, tuttavia, è notevolmente più dinamica e variegata. Le cellule che muoiono per apoptosi acquisire molteplici nuove attività, sia secreta e cellulo-associati, che consentano loro di influenzare la funzione di cellule vive adiacenti 4-10. Studi precedenti focalizzati sulla capacità delle cellule apoptotiche per sopprimere l'infiammazione 11-16, ma le cellule apoptotiche anche modulano una vasta gamma di funzioni cellulari, tra cui tali attività vitali come la sopravvivenza 4,9,10, la proliferazione 4,9,10, differenziazione 17, la migrazione 18, e la crescita 19. Inoltre, questi effetti non sono limitati a fagociti professionali, come macrofagis, ma si estendono a quasi tutti i tipi e le linee cellulari, comprese le cellule tradizionalmente non fagocitiche, come le cellule epiteliali ed endoteliali 7,9,10,18-21.
La risposta specifica delle cellule vive adiacenti a seguito dell'esposizione ad apoptosi delle cellule dipende da molteplici fattori che riguardano sia le cellule che rispondono vitali e le cellule apoptotiche stessi. Ad esempio, nonostante l'esposizione a cellule apoptotiche inibisce la proliferazione di entrambi macrofagi murini e renali prossimali cellule epiteliali tubolari (PTECs), questi due tipi di cellule differiscono notevolmente nella loro risposta di sopravvivenza di cellule apoptotiche 4,6,9,10. Apoptotico cellule favoriscono la sopravvivenza di macrofagi, ma inducono la morte apoptotica delle PTECs 4,6,9,10. In particolare, la risposta di cellule apoptotiche può differire anche tra rispondendo cellule dello stesso lignaggio, a seconda degli organi della cellula risponde di origine 10 (ad esempio, PTECs renali rispetto epiteliali mammariecellule) o stato di attivazione 22 (ad esempio, neutrofili). Viceversa, le cellule apoptotiche possono evocare risposte differenti nella stessa cella a seconda della natura del apoptotico di stimolo 10,23 o la fase di apoptosi 10,14.
Data la diverseness e la complessità della risposta di cellule apoptotiche, grande cura deve essere presa in sezionare gli eventi di segnalazione e percorsi responsabili per qualsiasi particolare risultato. In primo luogo, le risposte che richiedono l'interazione fisica diretta tra cellule vitali e apoptosi devono essere differenziati da quelli ottenuti con mediatori solubili rilasciati o generate dal cellulare per apoptosi 3,6-10. Se è richiesta l'interazione fisica, poi un ulteriore differenziazione deve essere eseguita. eventi di segnalazione possono dipendere riconoscimento mediata dal recettore della cellula apoptotica, indipendentemente successiva engulfment, o assorbimento fagocitaria, indipendente dal recettore specifico che lega la cellula apoptotica 3-7,9,10,19. In quest'ultimo caso, la risposta non è specifico per cellule apoptotiche, e può essere attivato da qualsiasi materiale fagocitaria 4,6.
L'importanza di queste distinzioni può ancora essere apprezzato contrapponendo le risposte dei macrofagi e PTECs renali. Per entrambi i tipi di cellule, l'esposizione a cellule apoptotiche altera l'attività della chinasi pro-sopravvivenza Akt. La modulazione dipende interazione fisica, poiché la separazione di rispondere e cellule apoptotiche da una membrana di policarbonato 0,4 micron abolisce la risposta 4,9,10,19. Tuttavia, la risposta di PTECs è mediata da recettori e indipendente fagocitosi, considerando che la risposta dei macrofagi è guidato da fagocitosi 4,9,10,19. Questa conclusione è rafforzata dal fatto che l'esposizione a sfere di lattice, uno stimolo fagocitaria neutra, non ha alcun effetto sulle attività di Akt in PTECs, ma imita l'effetto di cellule apoptotiche nei macrofagi 4,9.
"> Anche se meno ben studiato, le cellule che muoiono da necrosi, o morte cellulare accidentale 1, modulano anche la funzione delle cellule vitali vicina 3-10,19. Come le cellule apoptosi, le cellule necrotiche esercitano i loro effetti attraverso una varietà di meccanismi, in particolare la perdita dei contenuti intracellulari attraverso la loro rottura membrana cellulare 3,5,6,9,24. Molte cellule, tra cui PTECs e macrofagi, possiedono recettori non concorrenti distinti per le cellule morte da necrosi 5,9. impegno di questi recettori induce eventi di segnalazione che sono spesso opposti a quelli indotti mediante impegno dei recettori per le cellule apoptotiche 4-10,19. ad esempio, in PTECs, cellule necrotiche aumentano fosforilazione di Akt, mentre le cellule apoptotiche diminuiscono fosforilazione 9,10,19.Qui, descriviamo un protocollo per identificare gli eventi di segnalazione intracellulare indotti in PTECs renali vitali attraverso il riconoscimento mediata dai recettori di PTECs apoptotici adiacenti <sup> 9,10,19. Mentre il protocollo è specifico per una linea cellulare PTEC condizionalmente immortalate noto come cellule BU.MPT 9,10,19,25,26, è facilmente adattabile alle linee di cellule che non sono di origine epiteliale e / o derivato da organi diversi il rene. È importante sottolineare che l'uso di cellule apoptotiche come stimolo cella pone talune difficoltà inerenti sperimentali non presenti con ligandi solubili. Il più importante di questi è che le cellule apoptotiche devono essere aggiunti come sospensione piuttosto che come soluzione. Queste difficoltà, così come le strategie per ridurre al minimo o evitare loro, sono discusse all'interno del protocollo. Quasi tutte le tecniche descritte nel protocollo sono semplici e standard per coltura cellulare. Il vantaggio di questo protocollo sta nella sua attenzione alle molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche modulano la trasduzione del segnale all'interno delle cellule che rispondono. Questi meccanismi comprendono l'associazione tramite i determinanti di superficie o colmare le molecole a specifici recettori sulla ricellule spondente, il rilascio di mediatori solubili e / o l'innesto della macchine fagocitaria. cellule necrotiche sono inclusi in tutti gli esperimenti per garantire che i risultati sono specifici per la modalità di morte cellulare, e non una risposta generalizzata cellule morte. Un approccio attento, come raccomandato in questo protocollo, è fondamentale per la nostra comprensione dell'influenza continua espansione che le cellule morenti esercitano sui loro vicini in tempo reale, sia in salute e malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forniamo qui un protocollo per caratterizzare gli eventi di segnalazione intracellulare indotte nelle cellule vitali a seguito della loro esposizione alle cellule in fase di apoptosi, o altre forme di morte cellulare. Il protocollo sottolinea i molteplici meccanismi attraverso i quali l'esposizione a cellule apoptotiche possono modulare vie di segnalazione intracellulare all'interno delle cellule responder vitali. Questi meccanismi sono: l'interazione (tramite ponte molecole o fattori determinanti della supe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
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