Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
As células morrem por apoptose, também conhecida como morte celular regulada, adquirir várias novas actividades que lhes permitam influenciar a função de células vivas adjacentes. actividades vitais, tais como a sobrevivência, a proliferação, crescimento e diferenciação, estão entre as muitas funções celulares modulados por células apoptóticas. A capacidade para reconhecer e responder às células apoptóticas parece ser uma característica universal de todas as células, independentemente da linhagem ou órgão de origem. No entanto, a diversidade e complexidade da resposta às células mandatos apoptóticos que grande cuidado em dissecar os eventos de sinalização e vias responsáveis por qualquer resultado particular. Em particular, deve-se distinguir entre os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas podem influenciar as vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis, incluindo: o reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, libertação de mediadores solúveis pela célula apoptótica, e / ou acoplamento da phagomáquinas cytic. Aqui, nós fornecemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular que são induzidas nas células respondedoras viáveis após a sua exposição a células apoptóticas. Uma grande vantagem do protocolo encontra-se em atenção o que compensa a dissecção do mecanismo pelo qual as células apoptóticas modulam eventos de sinalização dentro de células que respondem. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha imortalizada condicionalmente rato renal proximal tubular de células (células BU.MPT), é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outras do que o rim órgãos. A utilização de células mortas, como um estímulo introduz vários factores exclusivos, que podem dificultar a detecção de eventos de sinalização intracelular. Estes problemas, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. A aplicação deste protocolo deve ajudar o nosso conhecimento expansão da ampla influência que as células mortas ou a morrer exercem sobre os seus vizinhos vivos, tanto na saúde como na diseaSE.
Introduction
Apoptose, ou morte celular regulada 1, contribui de forma essencial para a manutenção e desenvolvimento de tecidos. Vistos os mais simples, as licenças de apoptose envelhecido, danificado ou excesso de células de ser eliminados sem danos a tecidos circundantes 2,3. A contribuição de apoptose para a homeostase dos tecidos, no entanto, é consideravelmente mais dinâmico e variado. As células morrem por apoptose adquirir várias novas actividades, tanto secretada e associada à célula, o que lhes permite influenciar a função de células vivas adjacentes 4-10. Estudos anteriores voltadas para a capacidade das células apoptóticas para suprimir a inflamação 11-16, mas as células apoptóticas também modular uma ampla gama de funções celulares, incluindo actividades vitais tais como a sobrevivência 4,9,10, 4,9,10 proliferação, diferenciação 17, migração de 18 anos, e crescimento de 19. Além disso, estes efeitos não são restritas para os fagócitos profissionais, como macrófagoss, mas se estendem a praticamente todos os tipos de células e linhagens de células, incluindo tradicionalmente não fagocíticas, tais como células epiteliais e endoteliais 7,9,10,18-21.
A resposta específica de células vivas adjacentes após a exposição a células apoptóticas depende de vários factores que se relacionam com as células que respondem tanto viáveis e as próprias células apoptóticas. Por exemplo, embora a exposição a células apoptóticas inibe a proliferação de ambas as macrófagos murinos e as células epiteliais tubulares proximais renais (PTECs), estes dois tipos de células diferem dramaticamente na sua resposta de sobrevivência de células apoptóticas 4,6,9,10. Células em apoptose promover a sobrevivência de macrófagos, mas induzir a morte apoptótica de PTECs 4,6,9,10. Notavelmente, a resposta de células apoptóticas podem variar mesmo entre células que respondem da mesma linhagem, dependendo do órgão da célula responder de origem 10 (por exemplo, nos rins contra PTECs epitelial mamáriacélulas) ou do estado de activação 22 (por exemplo, os neutrófilos). Por outro lado, as células apoptóticas podem evocar respostas diferentes na mesma célula, dependendo da natureza do estímulo 10,23 apoptótica ou a fase de apoptose 10,14.
Tendo em conta a diversidade e a complexidade da resposta de células apoptóticas, muito cuidado deve ser tomado em dissecar os eventos de sinalização e responsáveis para vias qualquer resultado particular. Em primeiro lugar, as respostas que requerem interação física direta entre células viáveis e apoptóticos devem ser diferenciados daqueles provocada por mediadores solúveis liberados ou geradas pelo celular por apoptose 3,6-10. Se é necessária a interacção física, em seguida, uma maior diferenciação deverá ser executado. eventos de sinalização pode depender de reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, independente de imersão subsequente, ou na captação de fagocitária, independente do receptor específico que se liga a célula apoptótica 3-7,9,10,19. No último caso, a resposta não é específico para células apoptóticas, e pode ser desencadeada por qualquer material fagocítica 4,6.
A importância destas diferenças pode novamente ser apreciado por contraste as respostas de macrófagos e PTECs renais. Para ambos os tipos de células, a exposição a células apoptóticas altera a actividade da pró-sobrevivência quinase Akt. A modulação é dependente da interacção física, uma vez que a separação de células apoptóticas e de responder de uma membrana de policarbonato de 0,4 um suprime a resposta 4,9,10,19. No entanto, a resposta de PTECs é mediada pelo receptor e independente de fagocitose, enquanto que a resposta de macrófagos é impulsionado por fagocitose 4,9,10,19. Esta conclusão é reforçada pelo facto de a exposição a esferas de látex, um estímulo neutro fagocitária, não tem nenhum efeito sobre a actividade de Akt em PTECs, mas imita o efeito de células apoptóticas em macrófagos 4,9.
"> Embora menos bem estudadas, as células morrem por necrose ou morte acidental de células 1, também modulam a função de células viáveis nas proximidades 3-10,19. Tal como as células apoptóticas, células necróticas exercem os seus efeitos através de uma variedade de mecanismos, nomeadamente a fuga de conteúdo intracelular através da sua membrana celular rompido 3,5,6,9,24. Muitas células, incluindo PTECs e macrófagos, possuem receptores não concorrentes distintos para as células a morrer por necrose 5,9. Engagement desses receptores induz eventos de sinalização que são muitas vezes oposta às induzidas por acoplamento dos receptores de células apoptóticas 4-10,19. por exemplo, em PTECs, células necróticas aumentar a fosforilação da Akt, enquanto que as células apoptóticas diminuir a fosforilação 9,10,19.Aqui, descrevemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular induzidos em PTECs rins viáveis através do reconhecimento mediada pelo receptor de PTECs apoptóticos adjacentes <sup> 9,10,19. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha de células imortalizadas condicionalmente PCTEE conhecidas como células BU.MPT 9,10,19,25,26, é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outros órgãos o rim. Mais importante, a utilização de células apoptóticas, como um estímulo de células coloca certas dificuldades inerentes experimentais não apresentam ligandos solúveis. O mais importante destes é o de que as células apoptóticas deve ser adicionado como uma suspensão em vez de uma solução. Estas dificuldades, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. Quase todas as técnicas descritas no protocolo são simples e padrão de cultura de células. A vantagem deste protocolo reside na sua atenção para os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas modulam a transdução de sinal dentro das células que respondem. Estes mecanismos incluem a ligação via determinantes da superfície ou ponte moléculas a receptores específicos na recelular pondente, a liberação de mediadores solúveis e / ou do envolvimento da máquina fagocítica. células necróticas estão incluídos em todas as experiências para assegurar que os resultados são específicos para o tipo de morte celular, e não uma resposta generalizada de células mortas. A abordagem cuidadosa, como recomendado neste protocolo, é fundamental para a nossa compreensão da influência cada vez maior de que as células morrem exercem sobre os seus vizinhos ao vivo, na saúde e na doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui um protocolo para a caracterização dos acontecimentos de sinalização intracelular induzida em células viáveis após a sua exposição a células que sofrem apoptose, ou outras formas de morte celular. O protocolo enfatiza os vários mecanismos pelos quais a exposição a células apoptóticas podem modulam vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis. Estes mecanismos incluem: a interacção (via ponte moléculas ou determinantes da superfície sobre a cé…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
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