Identifiering av intracellulära signalerings händelser som framkallas i levande celler genom interaktion med angränsande celler genomgår apoptotisk celldöd
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
Celler som dör genom apoptos, även kallad reglerad celldöd, förvärva flera nya aktiviteter som gör det möjligt för dem att påverka funktionen av intilliggande levande celler. Vital aktiviteter, såsom överlevnad, proliferation, tillväxt och differentiering, är bland de många cellulära funktioner module av apoptotiska celler. Förmågan att känna igen och svara på apoptotiska celler tycks vara en universell egenskap hos alla celler, oavsett härstamning eller organ av origine. Emellertid, mångfalden och komplexiteten av svaret på apoptotiska celler mandat att stor försiktighet vidtas dissekera signalerings händelser och vägar som ansvarar för ett visst utfall. I synnerhet måste en särskilja bland de multipla mekanismer genom vilka apoptotiska celler kan påverka intracellulära signalsystem inom viabla responderceller, inklusive: receptormedierad erkännande av den apoptotiska cellen, frisättning av lösliga mediatorer av den apoptotiska cellen, och / eller ingrepp av phagocytic maskiner. Här ger vi ett protokoll för att identifiera intracellulära signaleringshändelser som induceras i livskraftiga svarsceller efter deras exponering för apoptotiska celler. En stor fördel med protokollet ligger i den uppmärksamhet det lönar sig att dissekering av den mekanism genom vilken apoptotiska celler modulerar signalering händelser inom svarande celler. Medan protokollet är specifik för en villkorligt odödlig mus njure proximala tubuli cellinje (BU.MPT celler), är det lätt att anpassa till cellinjer som är icke-epitelial ursprung och / eller härrör från andra källor än njuren organ. Användningen av döda celler som en stimulans introducerar flera unika faktorer som kan försvåra upptäckt av intracellulära signaleringshändelser. Dessa problem, liksom strategier för att minimera eller kringgå dem, diskuteras inom protokollet. Tillämpningen av detta protokoll ska hjälpa vår växande kunskap om det breda inflytande som döda eller döende celler utövar på sina levande grannar, både i hälsa och i disease.
Introduction
Apoptos, eller reglerad celldöd pt bidrar på ett väsentligt sätt till att upprätthålla och utveckla vävnader. Sett enklast, apoptos tillstånd åldern, skadad eller överskott celler som skall elimineras utan att skada omgivande vävnader 2,3. Bidraget från apoptos till vävnadshomeostas, är dock betydligt mer dynamisk och varierad. Celler som dör genom apoptos förvärva flera nya aktiviteter, både utsöndrade och cellassocierade, som gör det möjligt för dem att påverka funktionen av intilliggande levande celler 4-10. Tidigare studier fokuserade på förmågan hos apoptotiska celler för att undertrycka inflammation 11-16, men apoptotiska celler modulera också ett brett utbud av cellfunktioner, inklusive sådana viktiga aktiviteter som överlevnad 4,9,10, proliferation 4,9,10, differentiering 17, migration 18, och tillväxt 19. Dessutom är dessa effekter inte begränsade till professionella fagocyter, som makrofagers, men sträcker sig till praktiskt taget alla typer och härstamningar cell, inklusive traditionellt icke-fagocytiska celler, såsom epitel- och endotelceller 7,9,10,18-21.
Den specifika svar av intilliggande levande celler efter exponering för apoptotiska celler beror på flera faktorer som relaterar till både livskraftiga svarande celler och apoptotiska celler själva. Till exempel, även exponering för apoptotiska celler inhiberar proliferation av både murina makrofager och njur proximala tubulära epitelceller (PTECs), dessa två celltyper skiljer sig dramatiskt i deras överlevnad svar på apoptotiska celler 4,6,9,10. Apoptotiska celler främja överlevnaden av makrofager, men inducera apoptotisk död PTECs 4,6,9,10. Notably, kan svaret på apoptotiska celler skiljer sig även bland svarande celler av samma härstamning, beroende på den svarande cellens ursprungsorgan 10 (t ex njure PTECs kontra bröstepitelialcellerceller) eller aktiverings 22 (t.ex. neutrofiler). Omvänt kan apoptotiska celler framkalla olika svar i mycket samma cell beroende på naturen av den apoptotiska stimulans 10,23 eller stadiet av apoptos 10,14.
Med tanke på den diverseness och komplexiteten av svaret på apoptotiska celler måste stor försiktighet iakttas i dissekera signalerings händelser och vägar som ansvarar för ett visst utfall. Först måste svaren kräver direkt fysisk interaktion mellan livskraftiga och apoptotiska celler skiljas från dem som framkallas av lösliga mediatorer som frigörs eller genereras av apoptotiska cellen 3,6-10. Om fysisk interaktion krävs, så ska utföras en ytterligare differentiering. Signaleringshändelser kan bero på receptorförmedlad erkännande av den apoptotiska cellen, oberoende av efterföljande engulfment eller på fagocytisk upptagning, oberoende av den specifika receptor som binder den apoptotiska cellen 3-7,9,10,19. I det senare fallet är svaret inte är specifik för apoptotiska celler, och kan utlösas av någon fagocytiska material 4,6.
Betydelsen av dessa distinktioner kan återigen uppskattas av kontrasterande svaren från makrofager och njur PTECs. För båda celltyperna, exponering för apoptotiska celler förändrar aktiviteten av den pro-överlevnads kinas Akt. Modulering är beroende av fysisk interaktion, eftersom separation reagera och apoptotiska celler genom en 0,4 pm polykarbonatmembran avskaffar svaret 4,9,10,19. Emellertid är svaret hos PTECs receptormedierad och oberoende av fagocytos, medan svaret hos makrofager drivs av fagocytos 4,9,10,19. Denna slutsats förstärks av det faktum att exponering för latexpärlor, en neutral fagocytisk stimulans, har ingen effekt på Akt aktivitet i PTECs, men härmar effekten av apoptotiska celler i makrofager 4,9.
"> Även mindre väl studerade celler dör av nekros, eller oavsiktlig celldöd en, även modulera funktionen närliggande levande celler 3-10,19. Liksom apoptotiska celler, nekrotiska celler utövar sina effekter genom en mängd olika mekanismer, särskilt läckage av intracellulära innehåll genom deras brustna cellmembran 3,5,6,9,24. Många celler, inklusive PTECs och makrofager, har tydliga icke-konkurrerande receptorer för celler dör av nekros 5,9. engagemang av dessa receptorer inducerar signalering händelser som ofta motsatt de som induceras genom ingrepp av receptorerna för apoptotiska celler 4-10,19. till exempel i PTECs, nekrotiska celler ökar fosforylering av Akt, medan apoptotiska celler minskar fosforylering 9,10,19.Här beskriver vi ett protokoll för att identifiera intracellulära signaleringshändelser som induceras i viabla njur PTECs genom receptormedierad igenkänning av intilliggande apoptotiska PTECs <sup> 9,10,19. Medan protokollet är specifik för en villkorligt odödlig PTEC cellinje kallas BU.MPT celler 9,10,19,25,26, är det lätt att anpassa till cellinjer som är icke-epitelial ursprung och / eller härrör från andra källor än organ njuren. Viktigt är att användningen av apoptotiska celler som en cell stimulus medför vissa inneboende experimentella svårigheter som inte förekommer med lösliga ligander. Den viktigaste av dessa är att apoptotiska celler måste tillsättas som en suspension snarare än som en lösning. Dessa svårigheter, liksom strategier för att minimera eller kringgå dem, diskuteras inom protokollet. Nästan alla av de tekniker som beskrivits i protokollet är enkla och standard för cellodling. Fördelen med detta protokoll ligger i sin uppmärksamhet till de många mekanismer genom vilka apoptotiska celler modulerar signaltransduktion inom svarande celler. Dessa mekanismer innefattar bindningen via bestämnings ytan eller överbryggande molekyler till specifika receptorer på rerande cell, frisättningen av lösliga mediatorer, och / eller ingreppet av den fagocytiska maskiner. Nekrotiska celler ingår i alla experiment för att säkerställa att resultaten är specifika för läget av celldöd, och inte en generaliserad reaktion på döda celler. En noggrann metod som rekommenderas i detta protokoll, är avgörande för vår förståelse av den ständigt expanderande inflytande som döende celler utövar på sina levande grannar i både hälsa och sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi tillhandahåller här ett protokoll för karakterisering de intracellulära signaleringshändelser som induceras i viabla celler efter deras exponering för celler som genomgår apoptos, eller andra former av celldöd. Protokollet understryker de många mekanismer genom vilka exponering för apoptotiska celler kan modulera intracellulära signalvägar inom livskraftiga svararceller. Dessa mekanismer innefattar: interaktionen (via överbryggande molekyler eller determinanter ytan på de döda cellen eller dess skjul v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
