Identifikation af intracellulær signalering begivenheder induceret i levedygtige celler ved interaktion med naboceller Gennemgår apoptotisk celledød
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
Celler dør ved apoptose, også kaldet reguleret celledød, erhverve flere nye aktiviteter, der sætter dem i stand til at påvirke funktionen af tilstødende levende celler. Vitale aktiviteter, såsom overlevelse, proliferation, vækst og differentiering, er blandt de mange cellulære funktioner moduleret af apoptotiske celler. Evnen til at genkende og svare apoptotiske celler synes at være en universel træk ved alle celler, uanset afstamning eller organ af opkaldsoprindelse. Men mangfoldigheden og kompleksiteten af respons på apoptotiske celler mandater, stor omhu skal træffes i dissekere de signalering begivenheder og veje, der er ansvarlige for en bestemt udfald. Især må man skelne mellem de multiple mekanismer, som apoptotiske celler kan påvirke intracellulære signalveje inden levedygtige responderceller, herunder: receptormedieret anerkendelse af den apoptotiske celle, frigivelse af opløselige mediatorer af den apoptotiske celle, og / eller indgreb af phagocytic maskiner. Her giver vi en protokol til at identificere intracellulære signalsystemer begivenheder, der induceres i levedygtige responder celler efter deres eksponering for apoptotiske celler. En stor fordel ved protokollen ligger i den opmærksomhed, det kan betale sig at dissektion af den mekanisme, ved hvilken apoptotiske celler modulerer signalering begivenheder inden responderende celler. Medens protokollen specifik for en konditionelt immortaliserede muse nyre proksimal tubulær cellelinje (BU.MPT celler), er det let tilpasses til cellelinier, som er ikke-epitel oprindelse og / eller er fremstillet af andet end nyren organer. Brugen af døde celler som et incitament introducerer flere unikke faktorer, der kan hindre påvisning af intracellulære signalsystemer begivenheder. Disse problemer, samt strategier til at minimere eller omgå dem, der drøftes i protokollen. Anvendelsen af denne protokol skal hjælpe vores voksende viden om det brede indflydelse, som døde eller døende celler udøver på deres live naboer, både i sundhed og i diseaSE.
Introduction
Apoptose eller reguleret celledød 1, bidrager på en væsentlig måde til vedligeholdelse og udvikling af væv. Set mest enkelt, apoptose tillader alderen, er beskadiget eller overskydende celler, der skal fjernes uden skade på omgivende væv 2,3. Bidraget af apoptose til vævshomeostase, er imidlertid betydeligt mere dynamisk og varieret. Celler dør ved apoptose erhverve flere nye aktiviteter, både udskilles og celle-associeret, der sætter dem i stand til at påvirke funktionen af tilstødende levende celler 4-10. Tidligere undersøgelser fokuseret på evnen af apoptotiske celler til at undertrykke inflammation 11-16, men apoptotiske celler også modulere en lang række cellulære funktioner, herunder sådanne vitale aktiviteter som overlevelse 4,9,10, proliferation 4,9,10, differentiering 17, migration 18, og vækst 19. Desuden er disse effekter ikke begrænset til professionelle fagocytter, ligesom makrofags, men strækker sig til praktisk talt alle celletyper og slægter, herunder traditionelt ikke-fagocytiske celler, såsom epitel- og endotelceller 7,9,10,18-21.
Den specifikke reaktion af tilstødende levende celler efter udsættelse for apoptotiske celler afhænger af flere faktorer, der vedrører både de levedygtige responderende celler og apoptotiske celler selv. For eksempel, selv om udsættelse for apoptotiske celler inhiberer proliferation af både murine makrofager og nyre proximale tubulære epitelceller (PTECs), disse to celletyper varierer dramatisk i deres overlevelse respons på apoptotiske celler 4,6,9,10. Apoptotiske celler fremmer overlevelsen af makrofager, men inducere apoptotisk død PTECs 4,6,9,10. Især kan reaktionen på apoptotiske celler afviger selv blandt reagere celler af samme afstamning, afhængigt af den responderende celles organ oprindelse 10 (f.eks, nyre PTECs versus brystepitel-celler) eller tilstand af aktivering 22 (f.eks neutrofiler). Omvendt kan apoptotiske celler fremkalde forskellige reaktioner i selv samme celle afhængigt af arten af den apoptotiske stimulus 10,23 eller den fase af apoptose 10,14.
I betragtning af den diverseness og kompleksiteten af respons på apoptotiske celler, skal der udvises stor omhu i at dissekere de signalering begivenheder og veje, der er ansvarlige for en bestemt udfald. For det første skal reaktioner, der kræver direkte fysisk vekselvirkning mellem levedygtige og apoptotiske celler differentieres fra dem fremkaldes af opløselige mediatorer frigivet eller genereret af apoptotisk celle 3,6-10. Hvis fysisk interaktion er nødvendig, så bør der udføres en yderligere differentiering. Signaleringsbegivenheder kan afhænge af receptor-medieret anerkendelse af den apoptotiske celle, uafhængig af efterfølgende engulfment eller på fagocytisk optagelse, uafhængig af den specifikke receptor, der binder den apoptotiske celle 3-7,9,10,19. I sidstnævnte tilfælde, svaret er ikke specifik for apoptotiske celler, og kan udløses af ethvert fagocyterende materiale 4,6.
Betydningen af disse forskelle kan igen blive værdsat af kontrasterende svarene fra makrofager og nyre PTECs. For begge celletyper, udsættelse for apoptotiske celler ændrer aktiviteten af den pro-overlevelse kinase Akt. Modulation er afhængig af fysisk interaktion, da adskillelse af reagere og apoptotiske celler ved en 0,4 um polycarbonat membran afskaffer svar 4,9,10,19. Imidlertid reaktion PTECs er receptor-medieret og uafhængig af fagocytose, mens responset af makrofager er drevet af fagocytose 4,9,10,19. Denne konklusion forstærkes af, at udsættelse for latex-perler, en neutral fagocytisk stimulus, har ingen effekt på Akt aktivitet i PTECs, men efterligner effekten af apoptotiske celler i makrofager 4,9.
"> Selvom mindre godt undersøgt, celler dør ved nekrose eller utilsigtet celledød 1, også modulere funktionen af nærliggende levedygtige celler 3-10,19. Ligesom apoptotiske celler, nekrotiske celler udøver deres effekt gennem en række mekanismer, navnlig lækage af intracellulært indhold gennem deres bristet cellemembran 3,5,6,9,24. Mange celler, herunder PTECs og makrofager, besidder forskellige ikke-konkurrerende receptorer for celler dø ved nekrose 5,9. Indgreb af disse receptorer inducerer signalering begivenheder, der er ofte modsat dem, der induceres ved indgreb af receptorerne for apoptotiske celler 4-10,19. for eksempel i PTECs, nekrotiske celler øger phosphorylering af Akt, hvorimod apoptotiske celler falde phosphorylering 9,10,19.Her beskriver vi en protokol til at identificere intracellulære signalsystemer begivenheder induceret i levedygtige nyre PTECs gennem receptor-medieret anerkendelse af tilstødende apoptotiske PTECs <sup> 9,10,19. Mens protokollen er specifik for en betinget udødeliggjort PTEC cellelinie kendt som BU.MPT celler 9,10,19,25,26, er det let tilpasses til cellelinjer, der er ikke-epitelial oprindelse og / eller stammer fra andre end organer nyrerne. Vigtigt er, at brugen af apoptotiske celler som en celle stimulus frembyder visse iboende eksperimentelle vanskeligheder ikke er til stede med opløselige ligander. Den vigtigste af disse er, at apoptotiske celler skal tilsættes som en suspension snarere end som en opløsning. Disse vanskeligheder, samt strategier til at minimere eller omgå dem, der drøftes i protokollen. Næsten alle teknikkerne beskrevet i protokollen er ligetil og standard til cellekultur. Fordelen ved denne protokol ligger i dens opmærksomhed på de mange mekanismer, som apoptotiske celler modulerer signaltransduktion inden responderende celler. Disse mekanismer omfatter bindingen via overfladen determinanter eller brodannende molekyler til specifikke receptorer på rerende celle, frigivelse af opløselige mediatorer, og / eller ansættelse af den fagocytiske maskiner. Nekrotiske celler er inkluderet i alle eksperimenter for at sikre, at resultaterne er specifikke for den tilstand af celledød, og ikke en generaliseret reaktion på døde celler. En omhyggelig tilgang, som anbefalet i denne protokol, er afgørende for vores forståelse af den stadigt voksende indflydelse, døende celler udøver på deres live naboer i både sundhed og sygdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi leverer her en protokol til karakterisering de intracellulære signalsystemer begivenheder induceret i levedygtige celler efter deres eksponering for celler undergår apoptose, eller andre former for celledød. Protokollen fremhæver de mange mekanismer, som eksponering for apoptotiske celler kan modulere intracellulære signalveje inden levedygtige responder celler. Disse mekanismer omfatter: interaktionen (via brodannende molekyler eller overflade determinanter på de døde celle eller dens stald vesikler og mikrov…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
Referências
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
